核酸提取经验及原理总结

核酸提取经验及原理总结主办单位：螺旋网主讲人：wsuquan时间：2008.4.21主要内容•一、核酸的发现、核酸的分类和功能、核酸的理化性质•二、细胞裂解•三、核酸提取•四、核酸纯化•五、核酸检测•六、核酸除杂质核酸的发现核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的，他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。脱氧核糖核酸（DNA）DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大（除RNA病毒外）。DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。核糖核酸（RNA）•RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子，根据RNA的功能，可以分为三种：信使核糖核酸（mRNA）；转运核糖核酸（tRNA）；核蛋白体核糖核酸（rRNA）。核酸的理化性质•RNA的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。细胞裂解•裂解原理•细胞的裂解方法•裂解方法的评价•样品与裂解液的比例细胞裂解-裂解原理•经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏、维持核酸结构的稳定等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。细胞裂解-细胞的裂解方法•机械方法•化学试剂法•反复冻融法•酶解法细胞裂解-裂解方法的评价•含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组DNA的首选。•高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。•含CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法。•SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组DNA污染的特点。细胞裂解-样品与裂解液的比例•裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。核酸提取•提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程。DNA提取的几种方法•1浓盐法•2阴离子去污剂法•4水抽提法•3苯酚抽提法RNA提取•总RNA的试剂盒快速提取•蛋白酶－热酚法•氯化锂法提取总RNA核酸纯化-方法•经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术•使用离子交换介质的纯化技术•密度梯度离心法•使用吸附介质的纯化技术核酸纯化-纯化方法评价•针对不同的用途，选择不同的纯化方法，任何一种方法他都有其优缺点，在试验中，没有错误的方法，只是选择的方法不正确。核酸纯化-醇的沉淀•沉淀的原理目的•沉淀剂的选择•沉淀温度的选择核酸纯化-醇的沉淀-目的•目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。核酸纯化-醇的沉淀-沉淀剂•醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。因此，少量核酸用异丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。核酸纯化-醇的沉淀-温度•如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。核酸纯化-核酸的洗涤洗涤目的方法•首先一定要将沉淀悬浮起来；•第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时(使核酸沉淀最终蓬松)；•第三是少量多次；•第四则是去上清要彻底。核酸纯化-核酸的溶解•其中RNA以水为主，DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。核酸纯化-核酸保存•核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。一般的我们选择，-20℃或70℃保存的稳定。如果温度不合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的pH值不合适导致的水解。还有一个不为人重视的，就是EP管对核酸的影响。核酸纯化-核酸的浓缩•应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。核酸质量的检测问题•关于紫外分光光度仪的检测•关于电泳检测关于紫外分光光度仪的检测•在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。关于电泳检测•观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。核酸中杂质的去除•肝糖元、淀粉及粘多糖•蛋白质的除去•不同类型核酸的分离•同类核酸的分离核酸中除杂质-肝糖元、淀粉及粘多糖•①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。核酸中除杂质-蛋白质的除去•①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。核酸中除杂质-不同类型核酸的分离•在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。•在DNA中加核糖核酸酸酶选择地破坏RNA，是除RNA比较有效的方法。核酸中除杂质-同类核酸的分离•DNA混合物的分离：主要是变性或降解的DNA和天然的分离。•RNA混合物的分离经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。螺旋网管理团队感谢你参与！