分子生物学(基因组、转录组、蛋白组)

MolecularGeneticsandGenomicsFallSemester,2010主讲教师：薛树林联系电话：84396024地址：金陵研究院316E-mail:[e-mail]植物应用基因组学与生物信息中心1.出勤及回答问题情况：30%（随机提问形式）2.期末考试：70%（闭卷）考核方式对于选修《基因组学》课程的同学，采取写一篇课程论文的考核方式（70%）。2学分，周五3-5节，教学楼B301References•Genomes2,Genomes3byBrownTA•GeneVIII,GeneIXbyB.Lewin•JournalsonPlantMolecularGenetics•《现代分子生物学》，朱玉贤，李毅著•《基因组学》杨金水著•《分子克隆实验指南》（第3版），萨姆布鲁克（美）主编Chapter1:Genomes,TranscriptomesandProteomesChapter2:StudyingDNAChapter3:MappingGenomesChapter4:SequencingandAnnotationofGenomesChapter5:EukaryoticNuclearGenomesChapter6:GenomesofProkaryotesandEukaryoticOrganellesChapter7:GenomeExpressionChapter8:GenomeEvolutionOutlineofthiscourseChapter1:Genomes,TranscriptomesandProteomes基因组（Genome）：由德国汉堡大学威克勒教授于1920年首创，指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。基因组学（Genomics）：由罗德里克于1986年首创，指研究生物的整个基因组，涉及基因组作图、测序和功能分析的一门学科。1.概述32亿个nt,2n=46,35,000个基因16,569bp,环形分子，多拷贝,37个基因•基因组所包含的生物信息的利用需要酶及其他参与基因组表达过程中一系列复杂生化反应的蛋白质的协同活性。•基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组由转录过程来维持。•基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。这是通过翻译过程来完成的。细胞的蛋白质库DNA由JohannFriedrichMiescher在1869年发现,这位瑞士生物学家当时在德国蒂宾根（Tubingen）工作。2.DNA2.1GenesaremadeofDNA奥地利神父孟德尔1865年根据7个碗豆性状的实验提出了遗传因子假说，认为每个性状由遗传因子控制，并提出了遗传因子的分离与自由组合两大遗传规律。证明基因由核酸(DNA或RNA)组成的3个著名实验：①肺炎双球菌的转化试验；②噬菌体感染实验；③烟草花叶病毒的感染实验。A.1928年，荷兰细菌学家格里菲斯（Griffith）的肺炎双球菌转化实验Griffith在研究肺炎球菌时发现肺炎球菌有很多不同菌株，其中有一种菌株它的球菌有毒性，能引起小鼠得败血病。这些有毒的球菌外面有保护作用的多糖胶状荚膜，使它们可以不被宿主的正常保护机构所破坏；当它们生长在培养基上时，每一个细菌长成一个明亮的光滑菌落，叫光滑型（S）菌株；另外一些菌株无荚膜，菌落粗糙，没有毒性，不会引起疾病，叫R型菌株。(1)(2)(3)(4)这表明无毒性的R型活细菌在与被加热杀死的S型细菌混合后，转化成了有毒性的S型活细菌。这些转化成的S型细菌的后代也是有毒性的S型细菌，可见这种性状的转化是可以遗传的。1944年，艾弗里从S型活细菌中提取了DNA，蛋白质和多糖等物质，然后分别加入到培养R型细菌的培养基中。结果发现只有加入DNA时，R型细菌才能转化成S型细菌。通过上述研究表明，DNA是使R型细菌产生转化的物质，所以DNA是遗传物质。B.噬菌体感染实验噬菌体T2有一个蛋白质的外壳，DNA裹在其中。当噬菌体T2感染大肠杆菌时，它的尾部吸附在菌体上。然后，菌体内形成大量噬菌体，菌体裂解后，释放出几十个乃至几百个与原来感染细菌一样的噬菌体T2。构成蛋白质的氨基酸中，甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫，DNA中不含S，所以S只存在于T2噬菌体的蛋白质。相反，P主要存在于DNA中，至少占T2噬菌体含磷量的99％。AlfedHershey和MarthaChase(1952)将宿主菌细胞分别放在含35S或含32P的培养基中。宿主细胞在生长过程中就被35S或32P标记上了。然后用噬菌体去感染分别被S或P标记的细菌，并在这些细菌中复制增殖。宿主菌裂解释放出很多子代噬菌体，这些子代噬菌体也被标记上35S或32P。接着，用分别被35S或32p标记的噬菌体去感染没有被放射性同位素标记的宿主菌，然后测定宿主菌细胞带有的同位素。被35S标记的噬菌体所感染的宿主菌细胞内很少有35S，而大多数35S出现在宿主菌细胞的外面。也就是说，35S标记的噬菌体蛋白质外壳在感染宿主菌细胞后，并未进入宿主菌细胞内部而是留在细胞外面。被32p标记的噬菌体感染宿主菌细胞后，测定宿主菌的同位素，发现32p主要集中在宿主菌细胞内。所以噬菌体感染宿主菌细胞时进入细胞内的主要是DNA。由此可以得出结论：噬菌体注入宿主菌细胞内的物质是DNA，释放出来的是跟原先感染细菌细胞一样的噬菌体。可见在噬菌体的生活史中，只有DNA是联系亲代和子代的物质。C.烟草花叶病毒的感染实验对病毒的研究逐渐深入以后，发现一些植物的病毒仅含有RNA没有DNA。当用烟草花叶病毒（TMV）的RNA和蛋白质分别进行感染试验，发现只有RNA才能诱发感染。RNA也是遗传物质RNA蛋白质RNA酶处理2.2ThestructureofDNA核苷酸A.Nucleotidesandpolynucleotides2’-脱氧核糖多聚核苷酸3’,5’-磷酸二酯键DNA多聚核苷酸合成的聚合反应2.2ThestructureofDNAB.Themodelofdoublehelix•DNA晶体X射线衍射图谱•为揭示DNA分子的二级结构提供了重要实验证据QuickTime?andaTIFF(Uncompressed)decompressorareneededtoseethispicture.QuickTime?andaTIFF(Uncompressed)decompressorareneededtoseethispicture.威尔金斯弗兰克林a.WatsonandCrick(1953)提出的DNA双螺旋结构模型：DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。戊糖－磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2.37nm。Width2.37nm3.4nmQuickTime?andadecompressorareneededtoseethispicture.QuickTime?andadecompressorareneededtoseethispicture.QuickTime?andadecompressorareneededtoseethispicture.QuickTime?andadecompressorareneededtoseethispicture.QuickTime?andadecompressorareneededtoseethispicture.4314256尽管氢键使得双链中的碱基间的配对具有特异性（只有互补的两条链之间才能形成DNA双链），但其对于双螺旋的总体上的稳定性并无太大贡献。核酸分子的稳定性的根源在于碱基对之间的疏水堆积力。作为芳香族化合物，碱基的平面使其不能在自由溶液中与水分子形成氢键，即它们是疏水的。疏水效应使双链DNA成为能量上最为稳定的结构。尽管这种堆积作用在RNA中也存在，但其在双链DNA中达到了最大化。b.DNA双螺旋结构的稳定力：•碱基间形成的氢键•相邻碱基间的疏水堆积力•碱基相互作用的范德华力c.DNA双螺旋结构的类型:三种形态的DNA：A-DNA,B-DNA,Z-DNA两类：右手螺旋和左手螺旋ABZABZMiMaMaMiMiMa较宽，结构更紧密，是RNA及RNA与DNA杂合体的主要螺旋形式单一交替的嘧啶－嘌呤序列如5’-CGCGCG-3’不是体内核酸的主要形式所有DNA的稳定形式111210DNA双螺旋不同构象的特征螺旋直径螺距3.RNAandtheTranscriptome•基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。•转录组中的RNA分子以及其他来自非编码基因的RNA都由转录过程产生。3.1ThestructureofRNA核糖A,C,G,U1.稳定性差2.主要以单链形式存在2’,3’-环磷酸二酯依赖模板的RNA合成DNA-dependentRNApolymerases3.2细胞内的RNA组分•一个典型的细菌细胞含有0.05–0.10pg的RNA，约占其总质量的6%。•一个哺乳动物细胞，比细菌大得多，含有20–30pgRNA，但是只占细胞总质量的1%。细胞内的RNA组分核小RNA核仁小RNA微小RNA短干扰RNA构成转录组所有生物仅真核生物核小RNA(SnRNA)：发现于真核生物细胞核中，与前体mRNA剪接成成熟mRNA的过程相关。核仁小RNA（snoRNA）：发现于真核细胞核的核仁区，在rRNA分子的加工过程中起到核心作用（比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基）。微小RNA（miRNA）和短干扰RNA（siRNA）：是调控个别基因表达的小RNA。3.3ProcessingofprecursorRNA末端修饰剪接剪切化学修饰pre-rRNApre-tRNARNAediting新的化学基团3.4Thetranscriptome•转录组虽然不到细胞总RNA的4%，却是细胞中最重要的组分，因为它包含了基因组表达的下一个阶段中所要使用的编码RNA。•转录组从不从头合成（denovo），一个细胞通过细胞分裂诞生时就接收了其上一代的部分转录组，并维持一生。•各蛋白质编码基因的转录过程并不是导致转录组的合成，而是通过替换被降解的mRNA来维持转录组，并通过开闭不同的基因的表达来改变转录组的组成。3.5转录组研究的方法A.通过序列分析研究转录组•研究转录组最直接的方法是将其中的mRNA转变为cDNA，并对所有cDNA克隆进行测序，再与基因组序列进行比较分析。•还可以借助第二、三代测序技术直接对RNA进行测序。3.5转录组研究的方法A.通过序列分析研究转录组基因表达系列分析（Serialanalysisofgeneexpresion,SAGE）SAGE技术不是研究完整的cDNA，它产生长度12bp的短序列，每一条都代表了转录组中存在的一种mRNA。技术基础：412=16,777,216bp，真核mRNA平均1500bp，412相当于11,000个转录物，这比最复杂的转录组中存在转录物数目还多，因此12bp序列能够代表某一种mRNA。BsmF1是一种不常见的限制性内切酶，它不在其识别序列内部，而是在识别位点下游10-14个nt处切割。SAGE纤维素微粒4bp频繁切割洗脱去除连接一个含有BsmF1识别序列的寡聚核苷酸•切下来的片段被收集起来，头尾相连以产生一个串联体，进行测序分析。•串联体中的各个标签序列信息被读取并与基因组中的基因序列比对，从而可以分析哪些基因被转录，表达水平如何。SAGE3.5转录组研究的方法B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组探针：原位合成并固化的寡聚核苷酸PCR产物cDNA优