分离纯化工艺

第三章分离纯化工艺及设计•中药分离纯化工艺是利用中药化学、现代分离技术、工程学等原理对中药中有效成分的提取分离过程进行研究，建立适合于工业化生产的中药提取分离纯化方法，是研究制药工业中中药分离与纯化的技术学科。中药分离纯化工艺是制药工程学的一个重要的组成部分，属于中药现代化生产的关键技术。•研究内容包括分离纯化技术的基本原理、工艺流程、设备及应用等。第一节分离纯化原理•中药分离纯化方法选择的基本依据是看分离对象是非均相体还是均相体，而分为机械分离和传质分离两大类。•机械分离处理的是两相或两相以上的混合物，通过机械处理简单地就可将各相加以分离，不涉及传质过程，例如过滤、沉降、离心分离、旋风分离和压榨等。•传质分离处理的既可是均相体，也可是非均相体，通过单个组分的物理-化学特性的差异进行分离，一般是依靠平衡和速率两种途径来实现。•取决于平衡的分离方法，是以各组分在媒介中的不同分配系数而建立的平衡关系为依据实现的分离过程，如蒸馏、萃取、色谱、吸附、结晶、闪蒸、离子交换等。•取决于速率的分离方法，主要是根据各个组分扩散速度的差异来实现分离的过程，如分子蒸馏、超滤、电渗析、反渗透和气体扩散等。实现分离的推动力可利用浓度差、压力差和温度差等。•近年来，一些先进新型分离技术受到高度重视，如超临界流体萃取、树脂吸附、膜分离技术、色谱分离、喷雾或冷冻干燥技术等，它们在天然药物的分离、纯化中发挥独特作用，在提高产品分离质量、节约能耗和环保等方面已显示出传统分离方法无可比拟的优越性。分离方法分离对象分离介质分离原理取决于平衡的分离方法蒸发液体热能蒸发压的差异蒸馏液体热能蒸发压的差异吸收气体溶剂溶解度的差异萃取：固-液液-液固体液体溶剂溶剂（与样品不互溶）溶解度的差异溶解度的差异结晶液体除去或提供热能溶解度不同，熔点不同吸附气体或液体固体吸附剂吸附能力的差异离子交换液体固体选择性、亲和性差异干燥/冷冻干燥湿固体热能固体和水的挥发度差异；水的蒸发/升华浸取固体液体溶解度差异泡沫吸附液体气泡和表面活性剂表面吸附凝胶过滤液体固体凝胶分子大小的差异色谱各物质的溶液固体（固定相）和液体（流动相）倍增的吸附或分溶取决于速率的分离方法气体扩散气体压力梯度穿过多孔膜的扩散速率差异热扩散气体或液体温度梯度不同的热扩散速率电渗析液体电场离子交换膜不同的电荷离子对膜的选择性渗透电泳液体（包括胶体）电场物质在电场下的迁移速率差异反渗透液体压力梯度和膜渗透压超滤液体（含高分子物质或胶体）压力梯度和膜对膜的透过率差异分离方法举例一、分离纯化方法（一）系统溶剂分离法较常用的作法是将中药的乙醇或甲醇提取液适当浓缩后，与某种担体（如硅藻土、硅胶等）混合均匀，干燥后，用极性不同的溶剂，极性由小到大分别提取。然后再选择方法进行分离。也可以将药材粗粉直接用极性不同的溶剂分别提取，得各个部分。中药成分及其较适用的提取溶剂中药成分的极性中药成分的类型适用的提取溶剂强亲脂性（极性小）挥发油、脂肪油、蜡、脂溶性色素、甾醇类、某些苷元石油醚、己烷亲脂性苷元、生物碱、树脂、醛、酮、醇、醌、有机酸、某些苷类乙醚、氯仿中等极性小中大某些苷类（如强心苷等）某些苷类（如黄酮苷等）某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）氯仿：乙醇（2:1）乙酸乙酯正丁醇亲水性极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些生物碱盐丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、粘液质、果胶、糖类、氨基酸、无机盐类水（二）两相溶剂萃取法萃取法是利用混合物中各成分在互不混溶的溶剂中分配系数不同而分离的方法。可将被分离物溶于水中，用与水不混溶的有机溶剂进行萃取，也可将被分离物溶在与水不混溶的有机溶剂中，用适当pH的水液进行萃取，达到分离的目的。1.简单萃取法在中药成分的系统研究中，常采用的方法是将中药水提取液适当浓缩，或将中药乙醇（甲醇）提取液适当浓缩，回收醇后，加入适量水，用极性不同的与水不混溶的有机溶剂，极性由小到大，如选用石油醚（或己烷）、氯仿（或乙醚）、醋酸乙酯、正丁醇，分别进行萃取，分别回收溶剂得到极性不同的萃取物。在某些情况下也可只选1～2种溶剂进行萃取。分离碱性成分（生物碱）或酸性成分，可调节溶液的pH值后再进行萃取是常用的方法。2.pH梯度萃取法此法是分离生物碱类成分、酸性及酚性成分的一种方法。是利用被分离成分的碱性或酸性不同而采用的方法。大黄中蒽醌类成分的提取、分离基本原理大黄中羟基蒽醌类化合物多数以苷的形式存在，故先用稀硫酸溶液把蒽醌苷水解成苷元，利用游离蒽醌可溶于热氯仿的性质，用氯仿将它们提取出来。由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离它们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差别，用柱色谱分离之。•A大黄酚R1=HR2=CH3B大黄素R1=OHR2=CH3C大黄素甲醚R1=OCH3R2=CH3D芦荟大黄素R1=HR2=CH2OHE大黄酸R1=HR2=COOH由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同,用pH梯度萃取法分离他们;大黄酚和大黄素甲醚酸性相近,利用其极性的差异,用柱色谱分离之.酸性EBDA≈C大黄提取分离流程图•3.连续萃取法为克服使用分液漏斗多次萃取的操作麻烦，可采用连续萃取器。这一仪器利用两溶剂的比重不同，自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。（三）沉淀法沉淀分离是在溶液中加入溶剂或沉淀剂，通过化学反应或者改变溶液的pH值、温度、压力等条件，使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方法。应用沉淀分离技术时，需要考虑三种因素：（1）沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，才能使目标成分得到较好分离，纯度较高；（2）对于一些活性物质（如酶、蛋白质等）的沉淀分离，必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏；（3）对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离，必须充分估量残留物对人体的危害。1.溶剂沉淀溶剂沉淀在有机化合物（如蛋白质、酶、多糖、核酸等）水溶液中加入有机溶剂（如乙醇、丙酮等）后，显著降低待分离物质的溶解度从而将其沉淀析出的一种方法。机理：溶质（待分离物质）在溶液中化学势发生变化造成溶解度的下降。优点：选择性好、分辨率高，因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀，溶剂易除去易回收。但条件控制不当容易使待分离物质（如蛋白质）变性。影响溶剂沉淀的操作条件：（1）溶剂的选择及其添加量溶剂必须是能与水相混溶的有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮等，其中乙醇最为常用，能沉淀蛋白质、核酸、核苷酸、多糖、果胶和氨基酸等化合物，且安全性最高。（2）样品浓度的确定对于蛋白质样品溶液的沉淀分离，如果样品浓度低一些，可以减少蛋白质之间的相互作用，防止共沉淀现象，但易引起蛋白变性，另一方面，如果样品浓度高一些，可以减少蛋白变性，有机溶剂的使用量也可减少，担控制不当易出现共沉淀现象，一般而言，控制蛋白质起始浓度为5~30mg/ml。（3）温度调节对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离，一般在低温条件下进行，大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而降低，可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。（4）pH值的调节蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH值影响，一般在等电点的溶解度最低。将pH值调节到溶液中多数蛋白质带有相同的净电荷，可减少蛋白质之间的相互作用，防止共沉淀。利用改变溶液的pH值可实现有选择的分段沉淀。（5）离子强度的调节低浓度的中性盐类增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，并且对蛋白质具有保护作用，防止变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需要更高的溶剂浓度。2.盐析沉淀在较低浓度的盐溶液中，酶和蛋白质的溶解度随盐浓度升高而增大，这称之为盐溶。当盐浓度增大至一定程度后，酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出，这称之为盐析。•盐析沉淀条件中，一般情况下，多价盐类的盐析效果比单价的效果好，阴离子的效果比阳离子的好。•在蛋白质溶液中，一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广。使用带金属离子的盐类时，可考虑添加一定量的金属熬合剂如EDTA等。3.沉淀剂沉淀添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物，从而从溶液中沉淀析出的方法，称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法，酸类及阴离子沉淀法，非离子型聚合物沉淀法以及均相沉淀法等。（1）金属离子沉淀法蛋白质在碱性溶液中带负电，金属离子与蛋白质中的—COOH、—OH、—NH2、—SH等基团反应生成难溶性的复合盐而析出，根据金属离子与蛋白质的相互作用关系，将金属离子分成以下三类：①与羧基、氨基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子有：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+等；②与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子有：Ca2+、Mg2+、Pb2+和Ba2+等；③与巯基化合物强烈结合的金属离子有：Hg2+、Ag+和Pb2+等。复合物中金属离子的去除，可通入H2S形成硫化物去除或添加熬合剂EDTA。（2）酸沉淀法一些含氮的有机酸如苦酸和鞣酸等能与有机分子的碱性基团反应生成难溶性的盐复合物析出，但这种盐复合物沉淀往往是属于不可逆反应，引起蛋白质发生变性，因此，需要采取预防蛋白质变性的措施，如采用温和的反应条件，并加入一定量的稳定剂（如抗坏血酸等）。许多无机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀，如磷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷、砷、硅的钼酸或钒酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由乙醚萃取出来。（3）非离子型聚合物沉淀法一些非离子型多聚物（如聚乙二醇、葡聚糖和右旋糖酐硫酸钠等）作为沉淀剂，能将溶液的一些有机物质沉淀分离出来，如蛋白质、酶、核酸、细菌、病毒等。非离子型聚合物沉淀法操作条件温和，不易引起生物分子的变性，少量的沉淀剂就能沉淀大量的生物大分子物质，并且沉淀后的多聚物容易除去。聚乙二醇（PEG）是应用较多的水溶性的非离子型多聚物，多用于沉淀蛋白质。当pH值越接近蛋白质电点，所需PEG浓度也越低。同时在一定范围内，PEG的相对分子质量越大沉淀效果越好。（4）均相沉淀法直接将沉淀剂加入溶液中，容易出现局部浓度过高，产生的沉淀物过于细小或者结构疏松，均匀不一，易吸附杂质影响纯度。借助于化学反应使溶液中缓慢而均匀地产生沉淀剂以获得较纯净的晶形或非晶形沉淀，这就是均相沉淀法。实现均相沉淀通常有以下手段。①在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂，使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。②利用某种试剂的水解反应使溶液的pH值发生变化，使pH值达到一定值时就会生成沉淀。③将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合，再缓慢蒸去溶剂，使之在缓冲条件下实现均相沉淀。（四）盐析法盐析法是在中药水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使某些成分在水中溶解度降低，从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。有些成分如麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂提取。（五）分馏法对于完全能够互溶的液体系统，可利用各成分沸点的不同而采用分馏法，中药化学成分的研究工作中，挥发油及一些液体生物碱的分离即常用分馏法。例如毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱，前者沸点为166～167℃，后者为226℃，彼此相差较远，即可利用其沸点的不同通过分馏法分离。一般说来，液体混合物沸点相差在100℃以上，可将溶液重复蒸馏多次即可达到分离的目的，如沸点相差在25℃以下，则需采用分馏柱，沸点相差越小，则需要的分馏装置越精细。（六）结晶法结晶法是分离和精制固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同来达到分离的方法。结晶法所用的样品必须是已经用其他方法提得比较纯的时候，才能采用此法精制，如果中药的粗提取部分的纯度很差，则很难得到结晶，因结晶乃同类分子自相排列，如果杂质过多，则阻碍分子的排列。有些中药成分的结晶若含有两种以上的成分时，就可用分步结晶法使之分离。结晶的纯度可由化合物的晶形、色泽、熔点和熔距、薄层色谱或纸色谱等作初步鉴定。一个单体纯化合物一般都有一