病毒性肝炎病原学研究现状

1第三节病毒性肝炎病原学研究现状目前，比较明确的肝炎病毒有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。此外，其他病毒如巨细胞病毒、EB病毒、黄热病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒、柯萨基病毒、ECHO病毒等也可致肝脏损害，但它们主要引起肝外的临床表现，故不在病毒性肝炎病原讨论范围。近年来又发现一些可引起肝脏炎症的病毒，HGV/GBV-C、TTV、TLMV和SEN病毒等，分别讨论如下：1.甲型肝炎病毒（hepatitisAvirus,HAV）HAV属小RNA病毒科，曾归类于肠道病毒属72型。但随后的研究表明，HAV的许多特性与肠道病毒属成员不同，主要表现在以下几个方面：①HAV核苷酸和氨基酸序列与其它肠道病毒不同。②HAV很难适应于细胞培养，复制慢且无细胞病变。③HAV对温度和药物等有抵抗，而其它肠道病毒则敏感。④HAV在pH1时稳定。⑤HAV只有一个血清型。⑥肠道病毒特异性单抗不能与HAV反应。据此现将其归为小RNA病毒科的一个新属――肝病毒属(hepatovirus)。HAV为正20面体立体对称球形颗粒，直径为27－28nm，无包膜。颗粒中包含病毒核酸，为线状正链RNA分子。病毒衣壳则由多拷贝的病毒3种多肽，即VP1、VP2和VP3组成。HAV基因组是一条长约7.5Kb（HM－175株为7478nt）的线状正单链RNA，具有感染性。基因组结构主要分成5’非翻译区-P1区-P2区-P3区-3’非翻译区—多聚A尾等部分，其中P1、P2和P3区合称为翻译区，分别编码不同的结构蛋白和功能蛋白(图1)。图1HAV基因组结构（刘克洲、陈智主编“人类病毒性疾病”P808）5’非翻译区（5’NTR）全长为734nt，是HAV基因组中最保守的区域。其中151～734nt为HAVIRES（internalribosomalentrysite）元件，在宿主细胞性蛋白多肽作用下，40S核糖2体亚单位与HAVIRES元件结合，以“非帽依赖方式”（Cap-independenttranslationmanner）在合适的起始密码处起始翻译。核糖体RNA与HAV的IRES结合，是病毒蛋白翻译的必由之路。如果这种结合不能正确和有效地进行，将严重阻碍病毒蛋白的表达。3’NTR在HAV毒株间差异较大，达20%，其功能不明，可能与HAVRNA合成调控有关。HAV翻译区位于第735～7415nt，以单顺反子的形式翻译约含2225个氨基酸的多聚蛋白。该区可分成P1、P2和P3三个功能区，分别编码结构蛋白（P1区蛋白）和两个非结构蛋白（P2和P3区蛋白，转录和调控蛋白）。HAV只有一个血清型，但可根据其核苷酸序列分成7个基因型（genotype），型间差异为15%～25%。基因型I、Ⅱ、Ⅶ仅来源于人，III型则来源于人或猿猴，Ⅳ、Ⅴ、和VI仅来源于猿猴。目前世界上流行或散发的人源HAV株绝大多数为基因Ⅰ型（IA和IB），约占80%，少数为基因III型（IIIA和IIIB），其它型极少。HAV在感染者体内呈准种（quasispecies）分布。准种是指遗传学上高度相关、个体之间又有差别的种群组合。感染者体内的HAV虽为同一基因型，但各自的基因组核苷酸序列又有差别，尤其是在VP1和VP3区，这种序列差别尤为明显，成为一群混合体，其构成可随疾病进展和药物治疗而变化。HAV在肝细胞内复制。脱去壳蛋白后，病毒RNA进入细胞质并与细胞核糖体形成多聚核糖体，然后将HAV的RNA翻译成一个多聚蛋白。多聚蛋白经自身或细胞蛋白酶的裂解而产生病毒的成熟蛋白质。其中HAV的RNA依赖性RNA聚合酶将病毒正链RNA复制成负链RNA，形成复制中间体。以负链RNA为模板复制产生多条正链RNA分子。子代RNA分子与核壳蛋白结合包装，形成完整病毒颗粒。HAV的抗原性不仅取决于抗原蛋白的一级结构，且与其立体构型有关。只有完整病毒颗粒或空衣壳（无RNA的病毒样颗粒）或五邻体才能激发产生中和抗体，而纯化的壳蛋白或合成多肽产生的抗体中和能力很弱或几乎没有，除非能形成类似病毒的立体构型。HAVVP3和VP1构成其主要中和抗原决定簇，VP2也可能参与抗原性的形成。2.乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）HBV与鸭肝炎病毒(DHBV)、土拨鼠肝炎病毒（WHBV）和地松鼠肝炎病毒（GSHV）归为嗜肝DNA病毒科（HepadnaViridae）。形态和结构HBV为直径42nm的球形颗粒，称Dane颗粒。由双层衣壳和核心组成。3外层衣壳为包膜（envelope），由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）组成。内层衣壳为核壳（nuclearcapsid），由乙型肝炎核心抗原（HBcAg）组成。核心（Core）内有双股部分环状DNA和DNA多聚酶。电镜下HBV感染者血清中可见三种不同形态的颗粒：直径22nm的小球形空心颗粒、宽22nm，长40～100nm的管状颗粒（以上二种颗粒均不含病毒的核酸）和直径42nm的双层球形颗粒，内含病毒核酸，称Dane颗粒，即为HBV颗粒。基因组的结构、功能及其编码蛋白HBV基因组为部分环状双股DNA，由正链和负链组成，负链为长链，呈闭合型的环状DNA，全长约3200个核苷酸，有转录和翻译蛋白的功能。正链为短链，呈半闭合型的环状DNA，全长为负链的50%～75%，与负链以碱基配对方式结合成双股DNA。正链没有转录和翻译的功能。负链5’端有11个碱基组成的重复序列称为DR1。同样，在正链5’端也有11个碱基组成的重复序列，称为DR2。DR1和DR2是HBVDNA成环和病毒复制的关键区域，与病毒复制有关（图2）。图2HBV基因组结构（李梦冬主编“实用传染病学”第二版P106）4HBV负链DNA有S、C、P和X4个开放读框区（openreadingframe,ORF）。S基因区：全长为1167bp。由S基因、前S1和S2基因组成，分别编码226个氨基酸的S蛋白或主蛋白（majorprotein）即HBsAg、108个和55个氨基酸的前S1蛋白和前S2蛋白。前S2蛋白和S蛋白结合称为中蛋白（middleprotein）。前S1蛋白、前S2蛋白和S蛋白结合称为大蛋白（largeprotein）。大蛋白、中蛋白和主蛋白均是构成HBV外膜的成分。HBsAg可以有a、d/y和r/w抗原决定簇，故可以分为多个亚型。“a”抗原决定簇为组中和抗原决定簇，对各个亚型有交叉保护作用。C基因区：包括前C基因和C基因，全长636bp。其中前C基因为87bp，编码29个氨基酸的信号肽（signalpeptide）。C基因为549bp，编码183个氨基酸的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）。从前C基因开始编码，连续编码至C基因，可以产生乙型肝炎e抗原（HBeAg）前体蛋白，由信号肽引导至细胞内质网，在前C区蛋白氨基端除去19个氨基酸和C蛋白羧基端除去富含精氨酸区而形成HBeAg。P基因区：是HBV基因组最长的开放读框区，与S基因区和部分C基因及X基因区重叠。全长2496bp，编码832个氨基酸的P蛋白，具有DNA多聚酶、逆转录酶和RNA酶H活性。在HBV前基因组RNA逆转录为负链HBVDNA须要逆转录酶（DNA多聚酶）作用。X基因区：全长为462bp，编码含154个氨基酸的乙型肝炎X抗原（HBxAg）。HBxAg具有反式激活HBV基因的作用，增强HBV基因的复制和表达。同时，还有反式激活细胞内原癌基因（oncogen）的作用，可能与肝癌的发生有关。HBV基因组在肝细胞内具有两种调控方式：其一是顺式调节，如启动子及增强子序列，以直接方式影响另外一些基因组的功能，是基因组内部调节方式；其二是反式调节，即基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物产生对另一部分基因片段表达的调节方式，如病毒基因组表达的反式激活蛋白，以其表达产物的间接方式参与另外一些基因的功能调节，可以对基因组内部的基因片段，甚至可以对另外细胞或病毒的基因组有调控作用。这种病毒蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用，影响了肝细胞的基因表达谱，是病毒感染慢性化以及引起感染的肝细胞发生恶性转化的重要的分子生物学机制之一。核内的Hbx可通过与DNA结合蛋白作用，激活转录因子或基本转录过程，通过反式激活转录元件而促进病毒的复制。HBx还能在DNA水平激活转录。而胞质中的HBx则主要通过刺激信号转导途径而引起一系列的反应，激活AP-1、NF-κB等一批转录因子，干扰细胞内信号转导通路反式激活转录，导致细胞的转录、增生。研究发现HBx的反式激活作用呈现明显的广谱性，能够反式激活多种同源或异源的病毒或细胞转录调节基因区，包括HBV增强子/核心启动子、S基因启动子，SV40的增强子及早期启动子，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子（HSV-TK），人T淋巴细胞I型病毒（HTLV-1）5的长末端重复序列（LTR）、人免疫缺陷病毒I型（HIV-1）、罗氏肉瘤病毒（RSV）及β-干扰素等的启动子．HBx也可反式激活聚合酶（pol）I、II、III启动子，并且对c-myc、HLA-DR、MHC-I及IL-8等都有反式激活作用。除了上述4种HBV蛋白外，近年来研究发现，从肝癌细胞系或肝癌组织甚至是外周血中发现有一种截短型前-S2/S基因表达产物――羧基末端截短型分子MHBst，它能够调控肝细胞某些基因表达从而影响细胞生长调节，也具有反式激活功能。这种变异的病毒表面中蛋白，由于缺失了位于C-末端的膜定位信号，未能进入分泌途径而在内质网（ER）滞留，其前-S2区指向胞质区，从而有机会与胞质蛋白相互作用，发挥其广泛的反式激活效应；而全长的MHBs蛋白可进入高尔基复合体而分泌。HBV表面抗原大蛋白（LHBs）同MHBst相似，具有同样的反式激活效应，并且也是与依赖于蛋白激酶C（PKC）的信号传导途径有关，调控细胞异常增生，引发HCC的发生。HBV前S1蛋白在酵母细胞及哺乳动物细胞（如HepG2细胞、中国仓鼠卵巢细胞）中，具有转录的反式激活功能。缺失突变分析显示前-S1氨基酸残基21-56对于转录活性是必需的，已知此段序列富含6个精氨酸残基，这是酸性反式激活因子常见的特征，而且前-S1含有HBV中和表位以及肝细胞受体结合位点，可见HBV前-S1蛋白是一种多功能的蛋白质。在HBV感染者体内的毛玻璃样肝细胞中，前-S1蛋白与转化生长因子α（TGFα）存在共表达的现象，进一步研究发现，在人肝癌细胞株HuH6中，前-S1蛋白能够转录反式激活TGFα启动子基因，增加TGFα的表达水平，在HBV感染的HCC中起着重要作用。病毒变异HBVP区编码的P蛋白具有逆转录酶活性。在HBV前基因组RNA逆转录为负链DNA时,因HBV的逆转录酶缺乏校正功能(proofreading)的功能,难以纠正其间可能发生的核苷酸的变异，致HBV基因组序列易发生。根据HBV基因组全核苷酸序列变异＞8%的原则将HBV分为A-G七种基因型，A型在全球内流行，B、C型主要分布在亚洲，D型主要分布在南欧（地中海、中东），E型分布在非洲，F型见于美国，G型主要分布在美国和欧洲。我国流行的基因型主要为B型和C型。HBV的变异可以发生在各个基因区。最常见为前C区第83位核苷酸（1896位核苷酸）发生由G被A替代，使第28位色氨酸（TGG）变为终止密码（TAG）,使HBeAg的产生终止。又如C基因启动子发生变异，亦可使HBeAg阴性。S区基因发生变异，在“a”抗原决定簇位点第124～147位氨基酸（AA124～147），尤其是AA145发生变异时，引起“a”抗原发生变异，使乙肝疫苗免疫产生的抗-HBs不能与变异病毒结合，引起免疫逃逸（immuneescape）而致免疫失败。又如在AA122～124间发生插入变异（insertionmutation）时，可发生变异的HBsAg，不能被一般试剂检出，出现HBsAg（-）6的HBV感染。前S区基因发生变异，亦可使PreS1和PreS2蛋白发生变异，不能被抗-PreS1和抗-PreS2中和，引起免疫逃逸。P区和X区基因发生变异，可以影响HBV的复制和表达。有严重变异时，使HBV复制终止。不同的慢性乙型肝炎患者血清中HBV