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第四章细胞工程与食品工业主要内容细胞工程的概念、研究范畴植物细胞培养动物细胞培养细胞融合技术在食品工业中的应用第一节、概述利用细胞生物学和分子生物学技术，应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合性科学技术。细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质1细胞工程的概念及研究范畴研究范畴•研究对象：植物细胞、动物细胞、微生物细胞•根据改造遗传物质的不同层次可分为：•大规模细胞培养•细胞融合•细胞拆合（核移植、细胞器移植）•染色体工程•胚胎工程（胚胎培养、胚胎移植）1、细胞培养•细胞培养是指微生物细胞、植物细胞、动物细胞在人工提供的体外条件下进行生长和繁殖。•三个层次：单个细胞培养、组织培养、器官培养•微生物一般划分到发酵工程•植物细胞和原生质体的培养可以用于育种，优良植株的快速生长。•动物细胞培养多用于产生有价值的细胞产物，如疫苗。产品检测、疾病治疗。1）植物细胞和组织培养技术2）动物细胞和组织培养技术动物3）细胞融合技术（体细胞杂交技术）细胞融合是指利用人工和自然的方法将两个或几个不同亲本细胞融合成一个细胞，用于改良或创造新的物种及生产单克隆抗体。四个步骤：细胞标记---融合的细胞进行遗传标记原生质体的制备---酶法破处细胞壁诱导细胞融合---两种或两种以上细胞按一定比例置于高渗溶液，加入诱导剂或物理方法促进融合筛选杂合细胞---利用遗传标记，筛选有双亲遗传特性的的杂合细胞。4)细胞拆合•细胞拆合是指通过物理或化学的方法将完整细胞的细胞核和细胞质分离开，或将细胞核吸出来，再将同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育成新的细胞或新的生物个体的过程，也包括各种细胞器的分离和重新组合。•最早：紫外线、激光破坏细胞核，再用微吸管将其它细胞核注入•后期：用微吸管将细胞核吸出，再注入其它去核细胞中，进行融合。4）细胞拆合－核移植技术5）染色体工程技术染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体从而定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。主要分为动物染色体工程和植物染色体工程.动物染色体工程主要采用对细胞进行微操作的方法(如微细胞转移方法等)来达到转移基因的目的.植物细胞工程目前主要是利用传统的杂交回交等方法来达到添加、消除或置换染色体的目的。6）胚胎工程技术胚胎工程技术是一项综合性繁殖生物学技术，主要包括体胚胎移植和分割技术、卵母细胞体外成熟和移植技术、胚胎冷冻保存、克隆动物及临床移植治疗疾病7）干细胞和组织工程8）细胞培养生物反应器2、植物细胞工程的应用紫杉醇(taxol)是从红豆杉属(TaxusL.)植物中分离出的一个具有独特抗肿瘤活性的二萜类化合物，现已应用于临床治疗卵巢癌和乳腺癌。三、动物细胞工程的应用1.在疫苗生产上的应用。将乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。2.生产单克隆抗体单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。3.繁育优良品种。目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。4.在干扰素生产上的应用是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再形成组织的一项技术。细胞培养第二节、植物细胞培养技术一、植物细胞工程的发展细胞学说的创立：1838～1839年间由德国的植物学家施莱登（Schleiden）和动物学家施旺（Schwann）所提出,直到1858年才较完善。理论基础和探索1902年，德国著名植物生理学家Haberlandt,提出细胞全能性学说，并首次进行高等植物的细胞培养实验，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。1756年，Moncean首先发现植物在受伤愈合的组织皮层能产生芽，因而预言这一途径可以成为一种繁殖方式培养技术建立植物细胞培养技术应用发展20世纪40年代：J.Bonner银胶菊组织培养生产橡胶。20世纪70年代：植物细胞培养生产药用成份。20世纪80年代：400多种植物，600多种代谢产物。40多种植物次生代谢产物达到或超过植株产量。20世纪90年代：1000多种植物。1.首先，要取材和除菌。用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。常用的消毒灭菌剂:效果较好的有几种化学试剂，如次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞等。二、细胞培养一般步骤2.其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中。3.最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。三.植物细胞培养基植物细胞的培养基:通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂等。用于植物细胞培养的基础培养基营养成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的要求培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。碳源和能源培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。维生素虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。植物生长激素四.愈伤组织和悬浮细胞培养技术愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织的结构。外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。愈伤组织的诱导①选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶②选择适宜的培养基：MS，B5，N6较高激素浓度丰富的有机附加物。培养基中有较高含量的无机氮源较低的蔗糖浓度③适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易碎愈伤组织的形成。要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎适宜悬浮培养适宜再生植株高表达细胞系的筛选建立一是悬浮培养物分散性好，外观疏松、色泽鲜艳二是均一性好三是生长速度快、次生代谢产物合成能力强五.单细胞培养技术机械法将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生化研究。缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少。1、单细胞分离方法酶法利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。加渗透压保护剂如甘露醇以防酶对细胞的损伤。加硫酸葡聚糖钾盐可提高游离细胞的产量。化学法利用利用化学药剂使细胞分离的方法。草酸钙处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获得分散细胞。秋水仙碱、2，4－D或LH。看护培养2、单细胞培养方法用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。平板培养将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。平板培养植板率优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。微室培养优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。六.提高植物细胞次级代谢产物含量的方法加入前体物或诱导物前体物：次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物。诱导物：一类能引起植物细胞代谢强度变化或代谢途径改变的物质。植物细胞大规模培养在食品工业中的应用（1）利用植物细胞工程生产香料（2）生产食品添加剂（3）生产天然食品七、植物细胞大规模培养植物细胞大规模培养的特点①植物细胞对剪切力敏感。②植物细胞培养通常形成细胞团。③植物细胞生长速度慢，操作周期长④多泡沫。⑤植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。⑥植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。⑦大多数植物细胞培养需要光照。1.植物细胞悬浮细胞培养悬浮细胞培养技术悬浮培养优势把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养1）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。2）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高的问题。3）能充分保证氧的供给。2.植物细胞固定化培养植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。固定化培养技术（1）有利于次生物质的合成、积累；（2）减弱剪切力损伤；（3）有利于连续培养和产物的收集；固定化培养优势1）悬浮培养生物反应器植物细胞大规模培养的初期（20世纪70年代），主要采用微生物培养用的机械搅拌反应器。1972年，Kato首先用机械搅拌反应器培养烟草细胞以获取烟碱。Fujita利用这种反应器生产紫草宁。3.植物细胞培养生物反应器机械搅拌反应器机械搅拌植物细胞反应器机械搅拌反应器的优点及存在的问题优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获得高的溶氧系数(KLa＞100h-1)，植物细胞培养一般只需要KLa在5-20h-1之间就够了；再是反应器的温度、pH值、溶氧及营养物质的浓度较易控制。存在的问题：主要问题是剪切力问题；对只需较低kLa的植物细胞培养，促进氧传递的机械搅拌，每单位体积消耗的功率比气体搅拌要大；机械搅拌需搅拌轴，由此又带来了无菌密封问题。非机械搅拌反应器通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡式反应器和气升式反应器，气升式反应器又可分为外循环和内循环式。我国的刘大陆、查丽杭等发明了“气升内错流式”植物细胞培养反应器用于培养紫草，紫草宁含量达到了干细胞重的10%，是天然植株的2-8倍。气体搅拌反应器的优点及存在的问题优点：剪切力小，对植物细胞损伤小；因没有搅拌轴而更易保持无菌；操作费用低。不足：因气体搅拌强度低，高密度培养时混合不够均匀。靠大量的通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热。但过量的通气易排除培养液中的二氧化碳和乙烯，对于细胞生长有阻碍作用。再是过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。2)固定化细胞生物反应器固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。优点：单位体积细胞多，受剪切力小。缺点：由于其混合效果低，对必要的氧传递，pH值、温度控制和气体产物(如C02)的排除造成了困难。再者支持物颗粒破碎易堵塞填充床。填充床反应器Jones在填充床反应器中进行了固定化胡萝卜的培养，Kargi采用这种反应器培养长春花流化床反应器优点：良好的传质特性。缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞，同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。典型的流化床反应器是利用液体或气体的流动使支持物颗粒处于悬浮状态。Hamilton用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。膜反应器优点：可以重复使用。另外，流体易控制，易放大，而且能提供更均匀的环境条件。膜具有选择性，有利于产品分离。缺点是构建膜反应器的成本较高。第三节、动物细胞培养技术19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象。1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。1．融合现象的发现一、动物物细胞工程的发展1859年，A.