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班级：14制药3姓名：潘攀学号：1401020329L-天冬酰胺酶的基本介绍L-天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，它在血液中特异性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨使某些肿瘤细胞因摄取不到足够的L-天冬酰胺而导致细胞增殖受到抑制，从而达到抗肿瘤目的，临床上用于治疗南急性淋巴细胞白血病等，是一种重要的抗肿瘤药物。L-天冬酰胺酶的分子结构1922年Clement发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚和甲醇，水溶液20℃储存7d，5℃储存14d均不减少酶的活力。干品50℃15min酶活力降低30％，60℃1h内失活，最适PH8.5，最适温度37℃。目前最常用制备L-天冬酰胺酶的方法是用大肠杆菌备。右图是大肠杆菌形态图工艺路线大肠杆菌发酵生产工艺（1）工艺路线菌种培养菌种培养种子培养营养肉汤培养基玉米浆大肠杆菌→肉汤菌种→种子液37℃.4~8h37℃.6~8h发酵罐培养压滤、风干提取玉米浆丙酮硼酸缓冲液→发酵液→干菌体→提沉淀热处理HAC甘氨酸取液→粗酶→酶溶液PH4.2~4.460℃.，30min精制聚乙二醇→无热原酶液→冻干→L-天冬酰胺酶•1菌种培养采用大肠杆菌EscherichiacoliA.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g37℃,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。•2种子培养培养基用玉米浆30kg，加水至300kg，接种量1%-1。5%，37℃，通气搅拌培养4-8h.3发酵罐培养取玉米浆100Kg，接种量8%，37℃，通气搅拌培养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。4、提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉家兔0.01mol/LpH8的硼酸缓冲液10L，37℃保温搅拌1.5h，降温到30℃，用5mol/L醋酸调pH4.4~4.4，压滤，滤液中加入2倍体积的丙酮，放置3~4h，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。取粗制酶1g,jiaru0.3/%甘氨酸溶液20ml，调节PH8.8，搅拌1.5h，离心收集上清，加热到60℃维持30min进行热处理。离心弃去沉淀，上清液加2倍体积的丙酮，析出沉淀后离心，收集酶沉淀，用0.01mol/L、pH8磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。5精制、冻干上述酶溶液调PH8.8，离心弃去沉淀，清夜再调PH7.7，加入5%聚乙二醇，使浓度达到16%。在2~5℃放置4~5d，离心得沉淀。蒸馏水溶解，加4倍量的丙酮，沉淀，同法反复1次，沉淀用PH6.4、0.05mol/L磷酸缓冲液溶解，得到精制酶溶液。调节pH至5~5.2，再加50%聚乙二醇，如此反复处理1次，即得无热原的L-天冬酰胺酶。溶于0.5mol/L磷酸缓冲液，在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥，即得注射L-天冬酰胺酶成品，每支1万或2万单位。（3）蔗糖溶液提取纯化工艺将菌体细胞加入5倍体积的蔗糖提取液（蔗糖40%，溶菌酶200mg/LEDTA10mg/L,PH7.5）。在30℃震荡2h,8000r/min离心30min,收取上清液，再加入硫酸铵至55%饱和度，调节pH7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀。取上清液家硫酸铵至90%饱和度，离心收集沉淀。将沉淀用50mmol/L、PH7.0的磷酸缓冲溶液溶解并透析，透析后的酶液，通过预先用50mmol/L、PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素色谱柱（1cm×30cm）,用30mmol/l磷酸缓冲液洗脱，流速为40ml/h,收集天冬酰胺酶活性组分，在调整PH4.8，通过预先用50mmol/L、PH4.9磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素色谱柱（1cm×8cm），用50mmol/L、PH5.2磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉。总收率31%，比活力220U/mg.（4）技术要点1：菌种选择及抗癌活性自从大肠杆菌中成功地提取了L-天冬酰胺酶之后，生产上均采用微生物发酵法制备L-天冬酰胺酶。通常采用大肠杆菌、黏质赛氏杆菌做菌种，国内用大肠杆菌。2：提取和纯化工艺L-天冬酰胺酶是胞内酶，通常采用先破壁后提取。可将收集偶记得菌体加入2~4倍的冷丙酮，溶解细胞膜上的脂类化合物，破坏细胞壁结构，提高壁的通透性，制成丙酮干粉，再悬浮于0.01mol/L、PH8的硼酸-硼酸钠缓冲液中，37℃搅拌提取，加入氯化锰沉淀核酸比活力2.26U/mg.改进用葡萄糖溶液提取细胞周质中的酶，多数细胞未发生破裂，提取液的粘稠度不大，用8000r/min离心除去沉淀，得到上清粗酶液，比活力4.8U/mg.改进前的工艺有6步，总收率18.8%。酶制剂的比活力为200.6U/mg，与日本的leunase和德国的crasnitin的比活力相似。蔗糖溶液提取工艺有3步，总收率31%，比活力为220U/mg。纯化技术，有用硫酸铵分级沉淀，饱和度达到43%，沉淀除去杂蛋白，再提高饱和度至85%沉淀酶，收集沉淀溶于蒸馏水，利用超滤或葡聚糖凝胶G-25脱盐；用有机溶剂沉淀，先用酶溶液pH调至pI附近，降低酶的溶解度，再用2倍体积的丙酮使酶沉淀。进一步纯化，可用乙醇分级沉淀，在中性条件中加入1.1倍体积的乙醇，沉淀除去杂蛋白，上清液用乙酸调节PH至等电点附近，再继续加入乙醇沉淀酶。在生产上，常采用聚乙二醇沉淀，是一种既简单又有效的方法，能较好的保持酶的活性。聚乙二醇是非离子型聚合物，易于酶形成复合型沉淀。所用聚乙二醇相对分子质量4000-6000，水溶液浓度为50%，加入后的终浓度为16%左右，PH7.7条件下，低温放置，产生复合物沉淀，沉淀物在PH6.4缓冲液中溶解，制的酶的精品，比活力达到150U/mg蛋白。小规模制备时，可用DEAE-纤维素色谱柱，色谱柱先用0.01mol/L、PH8磷酸缓冲液平衡，酸液上柱后，用磷酸缓冲液梯度洗脱，浓度变化范围为0.01-0.1mol/L，PH变化为6.4，收集酶活高峰部分，冷冻干燥即得高纯度L-天冬酰胺酶，比活力为200U/mg.3：报道实例酶具有催化活性，这是选择提取方法和操作条件的指标，从原料开始，在整个酶的提取和纯化工程中，贯穿着总活力和比活力的的比较，了解某一步的收率和纯度、分析和决定下步工艺的取舍等步骤。4：反复冻融法和超声破壁法据文献报道，提取方法除冷丙酮干燥破壁和蔗糖溶液提取法外，还有反复冻融法和超声破壁法。反复冻融法是将菌体在-30℃和室温两种温度反复冻融9次，用30mmol/L磷酸缓冲液（PH7.5）浸提30min,8000r/min离心20min.离心吸取上清酶液。超声破壁法是将1g菌体悬浮在40ml10mmol/L、PH7.5磷酸缓冲液中，超声波处理（输出功率300w、间隔30s）10min.处理过程中用冰浴降温。用氯化锰沉淀核酶4000r/min离心20min，吸取上清液。5：酶分子修饰20世纪70年代治癌成功以来，随着酶学的发展，对酶分子进行化学修饰，提高生物活性。降低抗原性，有了较大的进展。据国外报道，L-天冬酰胺酶游离氨基经脱氨、酰化、碳化三亚胺反应，可增强酶在血浆中的半衰期。若多聚体与酶偶联。如用丙氨酸-羧基酸酐处理。与L-天冬酰胺酶形成聚丙氨酸-天冬酰胺酶的复合物，可延长酶的半衰期。对天然酶的抗体反应减少了1/500-1/300.溶氧对大肠肝菌L-天冬酰胺酶的合成有严重影响通过装液量试验、接种量试验、葡萄糖试验和氧载体试验考察摇瓶发酵过程中溶氧对L-天冬酰胺酶合成的影响,通过通纯氧自控pH的发酵工艺进行溶氧控制和pH控制.结果:采用通纯氧自控pH的发酵工艺,可延长发酵周期,有效地防止菌体的过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83％,达到110u/mL.L-天冬酰胺酶的纯化将L-ASP与高效先导序列pelB融合使得L-ASP在细胞外表达，并L-ASP在的N末端添加了6个组氨酸序列标签，然后采用亲和层析法分离纯化得到L-ASP，成本高，并不适合大规模的工业化生产。经蔗糖破壁，硫酸铵分级沉淀、透析、DEAEDE52、QSepharoseFastFlow等步骤纯化得到的比活力高，SDS-PAGE检测时显示为一条带，RT-HPLC分析纯度达99%，最终回收率为50.5%，适合大规模的工业化生产。L-天冬酰胺酶的修饰L-ASP聚乙二醇化不但降级了胰蛋白酶对它的降解作用，而且修饰酶的抗原性与天然酶相比也大为下降。此外，聚乙二醇化L-ASP与传统的脂质体化L-ASP相比有明显的优势。微囊化修饰将L-天冬酰胺酶用半透膜性质的聚合物制成微囊性固定化酶，其大小一般为1~500mm.低分子底物可以自由出入胶囊膜，与酶接触而起反应，反应产物则因浓度不断增加而不断渗透出胶囊外面。微囊性固定化可以克服天然酶针剂出现的抗体抗原反应。该酶注射到人体后，对膜具有良好通透性的低分子底物，能长时间发挥作用，比天然酶的疗效好，而且急性毒副反应低。用固定化酶反应器进行体外净化血液中L-天冬酰胺方法：经固定化L-天冬酰胺酶装填于柱中或将其固定在酶板、酶管或血液透析膜上，使得血液从固定酶上通过，除去癌细胞生长所需的L-天冬酰胺，从而达到治疗的目的。改进的功能：由于酶不与体内器官直接接触，也就不会发生毒性和过敏反应。并且具有天然酶的高度专一性和温和条件下高效催化的特点，还具有一定的机械强度；酶经固定化后，稳定性有较大的提高，还可以反复使用也可储存较长时间。1.对病人身体有一定损害。约1/3～1/2病人有骨髓抑制，表现为白细胞和血小板下降，有的病人可有贫血、凝血障碍、局部出血、感染等。有人报告有的病人有心血管系统症状、脱发、蛋白尿等，极少数病人且可发生胰腺炎。2.可引起过敏反应，故用药前必须先用过敏试验，如有红肿、斑块，则为过敏反应。有过敏史的病人应十分小心或不用。3.不同药厂、不同批号的产品，其纯度和过敏反应均有差异，使用时必须慎重。4.有致畸胎作用，故妊娠早期应禁用。5.肝、肾功能严重损害者忌用。6.溶解后不宜长时间放置，以免丧失活力。对治疗白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶是第一种治疗癌症的酶。当L-天冬酰胺酶注射进入人体后，人体正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白质合成不受影响。而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说，本身不能合成L-天冬酰胺，外来天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解，因此蛋白质合成受阻，从而导致癌细胞死亡。使用L-天冬酰胺酶时，可能出现过敏反应，偶尔还可以发生过敏性休克，但停药后，这些副作用会消失。因此，在应用这种酶之前，应做皮试。在一般情况下，注射该酶出现的过敏性反应包括发热、恶心、呕吐、体重下降等。对比起可怕的白血病来，这些副作用是轻微的痛苦，在没有找到更好的治疗方法之前是可以接受的。另外芦笋内富含较多的L-天冬酰胺酶1概述白血病（Leukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆中的白血病细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻2特征白细胞呈恶性、无限制地增生，浸润全身各组织和脏器，周围血液血细胞有量和质的变化。抑制红细胞和血小板止血的产生，非常容易受伤、出血、感染。3分类临床上分为急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性非淋巴细胞白血病（ANLL）、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病。4死亡率•慢淋白血病发病在50岁以后，才明显增多•急性白血病若不经特殊治疗，其平均生存期可能只有三个月左右急性非淋巴细胞白血病M7血象目前,国内临床上应用的L2ASP主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进