质粒载体的构建

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质粒载体的构建-菜鸟入门手册dongkey制作本人刚刚完成质粒载体的构建,总结了一下,以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下,希望老鸟同学批评指教。一、确定插入的基因片段。首先要确定自己要插入载体中的基因片段,比如要做蛋白表达和功能,可以选择CDS区进行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是PCR解决了。那么就涉及到引物的设计。插入CDS基因片段的例子:找到CDS,根据CDS设计全长引物,然后加上内切酶的碱基片段(这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了),注意,前面要加上保护碱基!然后进行PCR。PCR后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。用乙醇沉淀法纯化PCR产物(具体见分子克隆一书)菜鸟体贴提示:要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶,然后分别添加在两条引物的5‘端,当然内切酶的温度最好是一致的,而且可以能够同时切开的(双酶切)。这可以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的BUFFER及其双酶切时的活性如何(当然是越大越好了)。内切酶的公司一般可以找NEB,TAKARA,TOYOBO等公司,本人用的是TAKARA。二、酶切将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是37度。菜鸟体贴提示:1、确定质粒和基因片段的量!!(宁少不多),根据说明书加样,一般是DNA+BUFFER+加内切酶。注意BUFFER的比例,有的是1×,有的是1.5×。2、确定内切的时间。这是比较讨厌的环节。切的时间不能短,也不能太长。最好是做一个梯度。注意,说明书的内切时间不一定就是标准的!!(本人经验是可以稍微切的时间长一点,也不用短了)3、确定酶切成功了。对于质粒,可以将空质粒和切开的质粒同时电泳跑,对比一下就知道了对于目的基因,很难,因为切开的是几个碱基而已,不过一般如果质粒切开,目的基因应该也会被切开的。酶切完成后,有两种方法回收1、电泳跑胶回收2、不跑胶,直接用纯化试剂盒回收。根据N多种理论,很多人建议用第一种方法较好。理由这里就不罗列了。三、感受态大肠杆菌的制备。这里建议按照分子克隆的CaCl方法进行制备(书上已经详细列出了步骤,菜鸟也能做的)。感受态的好坏关系到转化效率,因此要认真对待。不过貌似也不是很难。保存要在-80度保存,也有某位仁兄告诉我4度放一放效果更好,没有试过,书上都是-80度的。当然,放的太久转化效率会随时间而减弱。如果有钱的同学就不需要费那么多功夫了,直接买就是了。本人是买TAKARA的,300大洋,10支。四、连接很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是16度数个小时或者过夜,或者4度过夜,不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章,认为是时间越长越好,甚至建议4度放几天,我没有试过。16度可以用PCR仪创造,或者找一个泡沫盒,加上冰,水搞到15度左右,放入4度冰箱即可。我用的TAKARA的快速连接试剂盒,4度过夜。菜鸟体贴提示:1、通过电泳,粗略判定质粒和DNA的浓度比例。一般加入连接液的DNA:质粒=9:12、放入质粒和DNA的总量要适当,不可超过说明书,宁少不要多。五、转化按照分子克隆的步骤来。如果是买公司的感受态,根据公司的说明书。菜鸟提示:1、复苏的时间一定要掌握好,还有是装感受态的管子要薄,以有利于温度的传导。一般用恒温水浴。2、涂抹在培养皿上的时候,可以做一个梯度,200ul,300ul,400ul,一定要晾干。六、确定测序的克隆。一般在培养皿上挑10-30个左右的单克隆。加入培养液(含抗生素)过夜培养,后用2ul的培养液,加上步骤一的引物,进行PCR,电泳,看有没有目的基因的条带。然后将有条带的培养液提取质粒,双酶切,电泳看看有没有目的基因的条带。如果有的话,可以送去测序了。菜鸟提示:1、可以绕过PCR直接提取质粒酶切(如果挑的克隆太多的话,建议还是先PCR以缩小范围)。2、如果目的基因较小的话(如100-300bp),那么酶切后电泳加样要尽量多一点,因为切下来的目的基因的亮度对比质粒的亮度是100-330/数千bp分之一。七、测序结果的分析可以使用多种软件。这里不罗列了。菜鸟方法:一般公司发回来的有记事本或者WORD的排列好测序结果的序列。将它们复制到一个新的WORD文档中,调整好格式,如全部大写,没有空格,没有回车符号等。然后,将目的基因全长COPY,使用查找功能,看是否全符合。

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