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第三章分子克隆载体载体将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具特点：在宿主细胞内能够自主复制具备合适的酶切位点有一定的选择标记较高的拷贝数第一节质粒载体一、质粒载体的基本特征什么是质粒染色体外的遗传因子，能进行自我复制，多为超螺旋双链环状DNA，少数线状大小1~200kb多种特殊功能基因特征1.质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。2.质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。pUC系列质粒的复制单位来自质粒pMB1，但其拷贝数较高。pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅲ），依赖于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的产物。因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1（或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2～3千个质粒。3.质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群，如ColE1和pMB1，pSC101和p15A。4.转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合作用转移到新宿主内。它需要移动基因mob，转移基因tra，顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic。二、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来（一）选择标记1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。2．四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。3．氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1噬菌体（也携带Tn9）。cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基23kDa）。在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3‘）-Ⅱ,25kDa）的基因氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。5．琥珀突变抑制基因supF在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为UAA），或琥珀突变（突变为UAG），或乳白突变（突变为UGA）。supF基因编码细菌的抑制性tRNA，可在UAG密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr基因和ampr基因，只有当宿主含有supF基因时才会对Amp和Tet具有抗性。相应的，supE基因在UAG密码子上编译谷氨酰氨。6．其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因SacB，来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上sacB基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。pBR322BamHI片段(Tcr)PstI(Apr)片段重组分子I重组分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）PstI片段外源DNABamHI片段重组分子I涂布Ap平板Apr转化子分别转化E.coli(ApSTcS)重组分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr转化子影印到Tc平板上AprTcS为重组子AprTcr为原载体影印到Ap平板上ApSTcr为重组子即为非重组子利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程（二）筛选标记1．α-互补（α-complementation）α-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantplasmidcontaininginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantplasmid(containinsert)2．插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。三、质粒载体的种类1.克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。(1)pBR322质粒大小为4361bp，含有30多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr），其质粒复制区来自pMB1（如图3-3）。目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。利用四环素抗性基因内部的BamHⅠ位点来插入外源DNA片段，可通过插入失活进行筛选。(2)pUC18和pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的质粒载体，由pBR322改造而来，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点，复制子为ColEI这两个质粒的结构只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700。pUC系列质粒带有一段大肠杆菌Lac操纵子DNA片段，能编码β-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的gal-基因互补。当pUC质粒转化到gal-的宿主菌后，在含有诱导物IPTG和生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因区域时，造成Lac基因失活，在含有IPTG、X-gal的培养基上将生成白色菌落。2．表达载体该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件，详细情况见后文