实验五-人类染色体标本制备

实验五人类染色体标本制备【目的要求】1．熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。23【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分裂能力。培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素(PHA)可使处于G0期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/LKCl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。【实验用品】(一)材料：人外周静脉血。(二)器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。(三)试剂1.RPMI1640培养液(1)RPMI1640：RPMI1640固体培养基10.4g,溶于1000ml双蒸水中，抽滤除菌。(2)RPMI1640培养液：每100mlRPMI1640培养液中含RPMI164080ml、灭活的小牛血清20ml、PHA50mg、青霉素(终浓度100U/ml)、链霉素10000μg(终浓度100μg/ml)，15磅、20min高压灭菌的NaHCO3调pH至7.2～7.4，分装20小瓶，每瓶5ml。(3)配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20min高压灭菌。新瓶塞等橡胶类制品用水洗刷后，用0.5mol/LNaOH煮沸20min，自来水冲洗；用0.5mol/LHCl煮沸20min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，在双蒸水中浸泡24h；浸泡后取出晾干，包装后高压灭菌。使用过的橡胶制品用肥皂液洗后，再用自来水，蒸馏水、双蒸水冲洗，晾干包装后高压灭菌。无菌室用紫外灯消毒2h。进入无菌室前用肥皂彻底洗手，双手在新洁而灭溶液中浸泡20min，然后穿隔离衣，戴口罩、帽子，进入无菌室操作时，再用75％酒精擦手。在无菌室内，将RPMIl640粉剂10.4g，溶于1000ml双蒸水中，(RPMI1640粉剂较难溶，可用酒精灯微火稍加热，或通入CO2使pH降至6.0左右可溶解)。液体呈透明状说明已完全溶解，倒入细菌滤器中过滤除菌。在无菌室的超净工作台内，取适量已抽滤的RPMI1640加入成比例的灭活小牛血清、PHA、青霉素和链霉素，混匀，用经过15磅20min高压灭菌的5％NaHCO3调至pH7.2，分装成每瓶5ml，冰冻保存。已除菌过滤、未分装的RPMI1640也需冷冻保存。2．无菌肝素（500U/ml）：肝素注射液1支2ml（含12500U），加23ml无菌生理盐水混匀（或肝素粉剂，用时配成0.2%肝素液），经8磅15min高压灭菌，置4℃冰箱保存备用。3．其他试剂：0.01%秋水仙素、0.075mol/LKCl低渗液、Carnoy固定液、10%Giemsa染液。【实验操作】(一)染色体标本1.取材培养(1)采血：用无菌注射器吸取约0.2ml肝素液，来回抽动针筒，使肝素湿润针筒，戴上针头套；彻底消毒采血处皮肤，抽取静脉血约2ml，戴上针头套，转动针筒，使肝素与血液在超净工作台内，去掉针头套，用无菌棉球擦除针头上的血迹；用酒精棉球消毒盛有5ml培养液的培养瓶瓶塞，并将瓶塞在酒精灯火焰上过一下；在酒精灯火焰旁，将采血的注射器针头经培养瓶皮塞插入培养瓶中，每瓶接种血液约0.3ml(2)培养：培养瓶置37℃恒温箱中培养，当培养至68h，取出培养瓶，在超净工作台内，用注射器(5号针头)向培养瓶中加入0.01%秋水仙素1滴，轻轻摇匀，放回37℃恒温箱继续培养至72h2．气干法制片(1)收集细胞：将培养瓶中的培养物用吸管移入刻度离心管内，离心8～10min（1000r/min），弃上清液，为防沉淀物中细胞丢失，可适当留点上清液。(2)低渗：向离心管中加6m1预温37℃的0.075mol/LKCl低渗液，用吸管向离心管底部充气，轻轻将细胞沉淀冲散打匀，离心管放入37℃水浴箱中低渗处理15min。(3)预固定：低渗处理后，加Carnoy固定液约0.5～1ml，用吸管轻轻冲打混匀，预固定；然后离心8～10min(1000r/min)，弃上清液。预固定可防止细胞在固定时集聚成块。(4)固定：在沉淀物中加Carnoy固定液5m1，用吸管将沉淀物轻轻冲打均匀，室温下静置固定20min，离心8～10min(1000r/min)，弃上清液。固定有利于染色体在载玻片上展开，保持染色体结构完整；如固定不充分，则染色体形象模糊，染色体周围有胞浆背景。为提高制片质量，此步操作可重复一次。(5)制备细胞悬液、制片：弃上清，留下0.5ml左右的固定液，打匀，用滴管滴在干净的载玻片上，空气干燥，Giemsa染色5～15min。空气干燥已染好色的标本后可镜下观察。