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大肠杆菌基因工程—人胰岛素的生产讲述人599小组成员2016.11.7目录1.利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽2.胰岛素的生产方法3.产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽由于大肠杆菌繁殖迅速价格低廉，培养代谢易于控制，因此重组大肠杆菌在医用蛋白的大规模生产中具有重要的经济意义。尽管有些生物活性严格依赖于糖基化作用的真核生物功能蛋白无法用重组大肠杆菌进行生产，蛋白质生物合成后加工系统的缺乏使得某些人体蛋白难以折成天然构象，但仍有100多种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂的人体蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（HSA）、尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白（MT）、二硫键共价交联的二聚体蛋白巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）以及四聚体的血红蛋白(Hb）等。本次以重组人胰岛素为例，论述利用大肠杆菌生产外源基因表达产物的基本过程。胰岛素的生产方法人胰岛素是一种由两条多肽链(A链和B链)组成的蛋白质。胰岛素合成时，最初在胰岛B细胞内的附着核糖体上形成的是一条单链多肽———前胰岛素原，其进入内质网腔后，信号肽酶切除信号肽形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体，在高尔基体中切除连接序列(C链)形成A链和B链，然后通过二硫键将两者结合形成有生物活性的胰岛素。工业上可采用下列四种方法大规模生产人胰岛素：（1）从人的胰中直接提取胰岛素；（2）由单个氨基酸直接化学合成；（3）由猪胰岛素化学转型为人胰岛素；（4）利用基因工程菌大规模大规模发酵生产重组人胰岛素。产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略1A链和B链的编码区由化学合成，两个双链DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨酸密码子。重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种克隆菌分别合成β-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以及β-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白，再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。胰岛素AB链分别表达法的基本原理AB链分别表达法2人胰岛素原表达法虽然上述工艺路线并不比AB链分别表达更为简捷，而且需要额外使用两种高纯度的酶制剂，但由于其体外折叠成功率相当高，在一定程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得产品的生产成本仅为50美元/g。将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β-半乳糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。AB链同时表达法这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经溴化氢CNBr处理后，分离传话A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与第一种方法相似，其最大的缺陷仍是体外折叠的正确率较低，因此目前尚未进入应用阶段。3上述三种工程菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列插入到表达型质粒β-内酰胺酶基因的下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。小结14.52533感谢聆听还有202-2的小伙伴们