胰岛素基因工程

L/O/G/O基因工程法获取人胰岛素胰岛素概况•胰岛素是一种蛋白质类激素,体内胰岛素是由胰岛β细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多的细胞群，叫做胰岛。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素•胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制人工合成胰岛素的必要性•胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。胰岛素结构•胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键胰岛素立体结构胰岛素的性质•〖化学本质〗蛋白质•〖分子式〗C257H383N65O77S6•〖分子量〗5807.69•〖性状〗白色或类白色的结晶粉末•〖熔点〗233℃（分解）•〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/LNaOH)•〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸）或氢氧化碱溶液中易溶•〖酸碱性〗两性，等电点pI5.35-5.45•胰岛素的英文缩写，INS.（insulin）胰岛素的发现•胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现•1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列•1965年9月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质胰岛细胞根据其分泌激素的功能分为以下几种：①B细胞(β细胞)，约占胰岛细胞的60%～80%，分泌胰岛素，胰岛素可以降低血糖。②A细胞(α细胞)，约占胰岛细胞的24%～40%，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖。③D细胞，约占胰岛细胞总数的6%～15%，分泌生长激素抑制激素。胰岛素生物合成•胰岛素生物合成的控制基因在第11对染色体短臂上。在β细胞的细胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链——胰岛素原。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素，分泌到β细胞外，进入血液循环中。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部分随着胰岛素进入血液循环胰岛素的分类•动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体•半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素•生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同怎样获得人的胰岛素基因？怎样将目的基因导入到受体细胞中？怎样将重组质粒导入到受体细胞中？目的基因是否在受体细胞中表达？4123一、提取目的基因•基因的剪刀——限制性内切酶作用与特性：一种酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的内切点切割DNA分子。重播限制性内切酶•既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。二、提取质粒•使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。质粒——基因的运载工具•质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。（部分为RNA）现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子三、基因重组•取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒缝合，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。基因的针线──DNA连接酶DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。重播四、将质粒送回大肠杆菌为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。为使重组的DNA分子更容易进入受体细胞，常还要用一些物质（含有Ca++的物质，如CaCl2）对受体细胞进行处理，使受体细胞具有更大的通透性。导入扩增将质粒送回大肠杆菌•在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca++的物质，如CaCl2，这使细胞会吸收外源基因。此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。CaCl2法的作用机理感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。转化效率可达106－107转化子/微克DNA。感受态细胞（competentcell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。感受态细胞制备(CaCl2法)1、取－70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3mlLB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的500ml烧瓶中，370C剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）3、当菌落600nmOD值达到0.4-0.5时，将烧瓶取出放置冰水上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,8000g离心10分钟。4、弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。5、4℃,8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液.加2ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体。每管0.1ml分装，至4℃保存备用，24－48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于－70℃的低温冰箱中。五、胰岛素的产生在大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。L/O/G/OMercidevotreattention!