在体肠灌流模型及其在中药研究中的应用

上海中医药大学学报第24卷第3期2010年5月在体肠滩流模型友其在中褥研究中的应用张晓雷周明眉贾伟苟小军上海中医药大学中医方证与系统生物学研究中心(上海201203)【摘要】对在体肠灌流模型及其近年来在中药研究中的应用情况进行了概括总结,并探讨了应用在体肠灌流模型研究中药在体内的吸收规律从而为中药新药设计及制剂处方筛选提供科学依据。【关键词】在体肠灌流模型;中药;肠吸收;综述[中图分类号1H285[文献标志码]A[文章编号J一005一s61x(20一。)02一0087一06口服给药是传统的给药方式,其相对安全、方便,易被患者接受,目前口服药物制剂的开发已成为药学界的研究重点。口服药物欲发挥全身作用,吸收是关键,所以对吸收过程的研究有助于药物的结构设计、处方筛选、工艺优化。小肠是吸收的主要场所,也是研究口服药物吸收机理的主要部位。用于研究药物吸收的实验方法包括体内(药物浓度法等)、在体(在体灌流模型等)、离体(外翻肠环法、肠囊外翻模型等)及细胞模型法(Caco一细胞模型、HT29细胞模型等)4个类型。尽管肠吸收实验方法较多,但目前被广泛采用的方法主要有4种:药物浓度法、大鼠在体肠灌流法、大鼠外翻肠囊法以及Ca-co一2细胞模型法。其中,在体肠灌流法具有使用简单、准确性较高、测得的指标更接近体内的真实吸收情况等优点而被广泛采用。本文对在体肠灌流法的基本特点及其在中药研究中的应用情况进行综述。在体肠灌流模型1.1在体肠灌流模型及分类在体肠灌流是一种原位大鼠消化道确定药物吸收速率的技术。该模型的基本操作方法为:麻醉动物,打开腹腔,量取一定长度的肠段,两端插管,用等渗生理盐水冲洗肠内容物后换灌流液,用一恒速泵灌流肠腔,收集灌流液,测定不同时间灌流液的药物浓度。根据灌流方式的不同,在体灌流方法可以进一步分为:单向灌流、循〔基金项目〕上海市科委中药现代化招标资助项目(06DZ19713)〔作者简介〕张晓雷,男,在读博士生,主要从事中药生物药剂学与代谢组学研究。〔通讯作者〕周明眉,副研究员。E一mail:[e-mail]环灌流和振动灌流等类型。目前,国内多采用检测设备较简易的“在体循环法”〔‘一,〕评价药物在肠道的吸收,该法由于长时间(4一6h)以较高流速(2-5mFmin)回流供试液,而对肠勃膜造成损伤,导致药物的吸收增大,使测得值与真实值有较大偏差;国外多采用在体单向肠灌流模型[’4〕,该模型是FDA认可的研究药物吸收代谢的两大模型之一,该法以较低的流速(0.2一0.3mFmin)对某一肠段进行单向灌流,对肠壁勃膜的损伤小,且试验条件与口服给药后药物接触的肠道环境较接近,吸收速率稳定,与人体有良好的相关性〔’毛];而振动灌流法目前的报道比较少。1.2在体肠灌流模型的应用原理在体灌流模型的基本原理是假定药物的减少等于药物的吸收,通过测定灌流液中药物减少量来评价药物的小肠吸收(吸收速率及吸收量等),同时计算药物的吸收动力学参数,如药物吸收速率常数(Ka)、表观吸收系数(Papp)等。该模型常用于研究药物的渗透和吸收动力学。肠道的吸收能力和分泌能力非常强,正常情况下,每天可吸收多达16L的液体,同时,可分泌IL的液体,病理情况下分泌液体量为ro一20L。肠道吸收是一个肠腔与茹膜双向转运的动态平衡过程。肠段的灌流方法基于测量灌流前后肠腔内药物浓度的变化,而小肠在吸收过程中,不仅吸收药物,也吸收和分泌水分,肠腔内的水分改变显著影响药物的浓度,因此,必须测定水分的变化以对其进行校正。测定水分变化的方法有酚红或’4C标记法和重量法。目前酚红和’4C标记PEG的方法应用较多。然而,酚红会干扰一些药物的转运和分析,且灌流过ACTAUNIVERSITATISTRAI〕ITIONISMEDIC从15SINENSISpH从MACOLoGIAEQUEsHANGHAIVol·24No·3M叮,2010程中酚红往往也存在一定程度的肠吸收;标记的PEG由于具有放射性,存在人体安全性问题,且检测方法特殊,很难在普通实验室广泛应用;重量法简单方便,在校正肠道对水分的吸收后具有可行性和精密性,被越来越多地采用。1.3在体肠灌流模型的常用吸收参数及计算方法1.3.1在体循环肠灌流模型的常用吸收参数及计算方法〔’一8〕在体循环肠灌流模型,常用酚红做标记,根据酚红质量浓度计算出供试液的体积,根据每一时间段药物质量浓度和供试液体积的变化计算出肠循环液中的剩余药量(X),以InX对取样时间t作图得一直线,由直线的斜率求出吸收速率常数Ka(即根据Fiek方程原理计算药物的吸收参数);由t(h)剩余药量的变化值对零时间剩余药量的比求出t(h)药物吸收百分率。吸收速率常数K。:InX=InXO一K。·t吸收半衰期t。:(h)的计算公式:NW不,cQ‘。一Q。‘l药物吸收速率常数(Ka)的计算:_‘些竺丛恤、空I、。_仁一又力n/下/‘in.U葱。F药物表观吸收系数(Papp)的计算:l/2(h)=0.693吸收百分率PA(%)的计算公式:C。·V-C·V尸八(%)二(一万一去一已)火100%C。·叽C。:O时间时循环液中药物浓度;V。:0时间时循环液体积;C,:取样点时循环液中药物浓度;V。:取样点时循环液体积;t(h):循环液循环时间。1.3.2在体单向肠灌流模型的常用吸收参数及计算方法四在体单向肠灌流模型多采用酚红标记法和重量分析法对灌流液的流人和流出的体积进行校正,消除其体积变化的影响,进而计算ka和Papp等。酚红标记法的计算方法如下:净水流量(NWF)的计算:.__Q,.Cpoi。、NWFn。=斗(l-一)‘一“Z‘一C既、’药物吸收速率常数(Ka)的计算:_二,C。‘·Q。。‘、一Qln(长二一一六竺生)‘一e‘。·Q‘。’尸__,=一一aPP.02介ri以上公式中:Qi。和Qou。分别为肠道进、出口灌流液的体积(ml)(经过密度校正);Ci。、C。ut分别为肠道进、出口灌流液的浓度(林岁nil);CPRi。和CPR。Ut分别为肠道进出口灌流液中酚红的浓度(卜扩ml);l为灌流肠段的长度(Cm);r为灌流肠段的横截面半径(em),Q为灌流速度(0.ZmFml),t为灌流时间(0.25h),v为灌流肠段的体积,为二r,‘(Cm,)。Ka和Papp为最后4一5个时间段(45一105min)样品的平均值。1.4在体肠灌流模型的药物转运机制由于生物膜具有复杂分子结构和生理功能,药物的跨膜转运方式也呈现多样性,主要包括:被动转运、载体媒介转运(主动转运、p一糖蛋白介导流出等)及膜动转运(胞饮和吞噬作用)。见图1。吸收药物的量可以由P叩p表示,药物吸收的快慢由Ka表示;在体单向肠灌流模型可以用Papp和Ka来评价药物转运的方式,对于p一糖蛋白介导流出方式可以采用特殊的p一糖蛋白抑制剂(如维拉帕米)评价。一般根据Papp可将吸收性能分为3类:Papp0.03x10并C而S,吸收差;Papp0.2x104e而s,吸收完全;介于两者之间的为中等吸收〔’压l3]。根据此标准,可以判断药物在大鼠肠段的吸收情况。当药物吸收量随着药物浓度的增加而增大,而Ka不变,提示其吸收机制可能为被动扩散。卫vK。.PR二尸兰丛兰兰丝‘C。,’C朋。。门月门通细目旁路月道细口月道卜.双白蔺基人.作用药物表观吸收系数(Papp)的计算:尸aPI,.PR重量分析法:净水流量(NWF)的计算:C_二Cp。_、一口In(才兰不扮~)七jn.‘尸R,ou‘2畔l瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥瞥、、〕〕黝黝黝字字筹筹筹筹奋奋奋奋奋叹叹叹叹叹晓晓晓晓晓晓晓晓晓生生州州图1药物跨膜转运机制示意图上海中医药大学学报第24卷第3期2010年5月1.5在体肠灌流模型的优缺点在体肠灌流是一种原位大鼠消化道确定药物吸收速率的技术,具有以下优点:¹容易通过控制或改变实验条件来观察药物在肠中的整个消除过程和影响因素;º不切断血管及神经,保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损,同时也保证了血液及淋巴的供应,提高了生物活性L‘4〕,测得的吸收速率等指标与体内法相近,比离体法更接近机体内的真实吸收状态;»在体肠道灌流不仅提供了较高活性的组织,而且提供了额外的取样部位,既可从肠腔取样,又可从血液中取样;¼能避免胃内容物、消化道固有运动等的生理影响;½既可用作药物吸收研究亦可用作稳定性研究;¾可测定肠道代谢物;¿虽然这些研究常在麻醉的小动物上进行,但借助肠道插管,亦可在非麻醉的实验动物及人体上进行〔”〕;À建立了大鼠肠原位灌流实验取得的药物肠道渗透率同人体口服给予药物溶液后吸收的药物量之间的关系;Á重量分析法、无吸收物标记分析法均可分析小肠水分转运对药物浓度的影响;方法操便,准确性较高。尽管在体肠灌流模型优点很多,但是这种方法对受试动物的数量有要求,即必须具有一定数量的实验动物,以消除变异;由于小肠吸收并不是引起肠道内药物减少的唯一原因,肠勃膜的代谢和药物在赫膜的积累也会引起灌流液中药物量的减少,因此在体灌流的实验结果与实际情况存在一定的偏差。2在体肠灌流模型在中药研究中的应用2.1中药有效成分吸收机制的研究许多中药有效成分不能或很少直接吸收人血,造成了其生物利用度低;还有很多有效成分的生物利用度低是由于肠代谢造成的。应用在体肠灌流模型,并结合其他模型研究中药有效成分的胃肠道转运机制对理解中医药的科学内涵具有重要作用,也是中医药现代化研究中的一个重要内容。目前,在体肠灌流技术在中药肠吸收方面的研究热点主要集中在对黄酮类、昔类及生物碱吸收机制的研究,对皂昔类、菇类、多糖及其他化合物的研究也有报道。根据中药从基本单元到复杂体系的研究思路可以分为以下几种:2.1.1中药单体的吸收研究中药单体成分吸收机制的研究是中药吸收机制的最基础研究,目前有关中药单体成分吸收的研究报道也最多。刘睿等[’6〕运用在体单向灌流法研究发现丹酚酸B的小肠吸收存在高浓度饱和现象,在全肠道吸收良好,且在小肠内无特定吸收部位。吴迪等〔”〕运用单向灌流模型分别研究灌流速度、药物质量浓度、pH值以及吸收部位对磷酸川芍嗦吸收的影响,结果发现磷酸川芍嗓的吸收速率不受药物质量浓度的影响,而与灌流速度、灌流液的pH值和肠段部位有关;药物在全肠道吸收较好,吸收窗主要在小肠,且小肠内无明显的特定吸收部位。吴雅娜等[’8〕运用单向灌流模型,结果发现二氢欧山芹醇乙酸醋在大鼠4个肠段的Ka,Kapp大小顺序是结肠回肠十二指肠空肠,且结肠、回肠与十二指肠、空肠的Ka,Kapp有显著性差异:在61.93一165.14mg/L内,Ka,Kapp无显著性差异:在pH3.0至pH5.0内,Ka、Kapp无显著性差异。周萍等「’93运用单向灌流模型,结果发现木犀草素在肠道内无特定吸收部位,全肠段均有较好吸收,在肠豁膜的转运为被动扩散过程,且无特殊的吸收窗。刘颖等〔’0」运用大鼠在体肠单向灌流模型,并应用重量法校正灌流液体积,考察吸收部位等对蟾毒灵吸收的影响,结果发现蟾毒灵为全肠段吸收,吸收机制为被动扩散,灌流液pH值对药物吸收有影响,但药物浓度及P一gP对药物的小肠吸收基本无影响。2.1.2单味中药的吸收研究不同的中药具有不同的药效,其物质基础即化学成分也有所不同,中药发挥疗效往往是多种成分共同作用的结果,所以研究单味中药的吸收机制,也往往会以其中的某一种有效成分或几种有效成分为研究对象进行研究。吴雅娜等〔川运用单向灌流模型考察独活提取物I(总香豆素含量ro%)灌流液中3种成分的吸收情况,并与独活提取物n(总香豆素含量)60%)进行比较。结果表明,二氢欧山芹醇乙酸醋、蛇床子素及二氢欧山芹醇当归酸酷3种成分在大鼠小肠主要以被动扩散方式吸收;在各肠段均有吸收,其中结肠吸收最好,各肠段的Ka、PaPP是结肠十二指肠空肠回肠,且结肠的Ka、Papp值显著大于其他肠段;独活提取物n中3种成分的Ka、Papp值显著小于独活提取物I中相应成分。赵艳红等〔”〕采用大鼠在体肠灌流模型对淫羊蕾昔和淫羊霍总黄酮在大鼠各肠段的吸收特性进行研究,结果发现淫羊霍总黄酮中有多种成分在大鼠肠