药物毒理学动物实验基本知识与技术

DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU动物实验的基本知识与操作技术（Basicknowledgeandtechnologyforanimaltest）王安4/17/20209:36AM1DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM2【目的要求】掌握动物实验的目的、要求与局限性，以及3R原则；了解动物实验设计的基本原则与方法；熟悉动物实验常用的动物选择、动物的编号和随机分组、染毒方法等技术；熟悉常用生物材料的采集。DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSUⅠ.动物实验的基本知识1.动物实验的目的、要求与局限性2.动物实验的职业道德-3R原则3.动物实验设计的基本原则与方法Ⅱ.动物实验的操作技术1.健康动物的选择，动物的抓取与固定2.动物的性别与日龄鉴定3.动物的标记与编号4.给药途径(口、呼吸道)5.生物材料的收集(血液、尿液)6.动物的处死及生物材料的采集4/17/20209:36AM3【主要内容】DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM4PartⅠ.动物实验的基本知识DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM5实验动物(Laboratoryanimals)是专门培育供实验用的动物，主要指作为医学、药学、生物学、兽医学等的科研、教学、医疗、鉴定、诊断、生物制品制造等需要为目的而驯养、繁殖、育成的动物。豚鼠新西兰家兔ICR小鼠Wistar大鼠Beagle犬一、动物实验的目的、要求、局限性DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM61.动物实验的基本目的评价化学物的生物学效应；阐明可能的机制和影响因素；补充人体资料的不足。DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM72.动物实验的基本要求健康(雌性曾交配与未孕)，均一性要求阐明剂量-效应关系，有高剂量接触组尽可能反映人类实际的接触途径DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM83.动物实验的局限性种属外推的不确定性高剂量向低剂量外推的不确定性样本量到大样本外推的不确定性无法观察主观指标DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM9二、动物实验的职业道德-3R原则实验动物在人类认识生命、预防与治疗疾病的医学发展史上，作出了大量牺牲。18世纪哲学家Jeremy指出：问题不在于它们能否思考，也不是它们能否说话，而是它们痛苦不痛苦。19世纪兴起动物保护主义，成立了动物保护组织，并且通过立法来保障动物福利。《禁止虐待动物法》、《科学动物实验法》、《动物福利法》、《实验动物管理条例》等。给予实验动物人道主义的管理与处理使痛苦与不适感减少到最低限度避免不必要的使用动物DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM101959年英国动物学家William和微生物学家Rex在《人性动物实验技术原则》一书中提出：“正确的科学实验设计应考虑到动物的权益，尽可能减少动物用量，优化完善实验程序或使用其他手段和材料替代动物实验的3R原则”。1.减少(Reduction)：减少是在满足实验要求，又不损失应得信息的前提下，尽可能减少实验动物的数量；2.优化(Refinement)：优化是在动物实验时，尽可能选择和改良实验操作技术，减轻动物可能遭受的痛苦；3.替代(Replacement)：替代是不通过与动物相关的实验或过程去获取所需的信息。动物实验替代法的3R原则DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM113R原则使全世界的生物化学、药理学、毒理学和生物医学界对替代方法的发展、验证更加关注，因为替代方法的研究不单纯是动物权益保护问题也是科学本身发展的问题，对于建立一个合理的实验设计，使科研更人性化，科学技术更先进化具有重要意义。目前通过正式验证的替代方法有：急性毒性实验：如上、下法、固定剂量法；皮肤腐蚀性：大鼠皮肤经皮电阻实验和人重组皮肤模型实验；皮肤变态反应：小鼠局部淋巴结试验；皮肤光毒性：3T3中性红摄取光毒实验，猪皮经皮吸收实验，诱变和光诱变性实验；胚胎毒性：全胚胎培养、微团实验和胚胎干细胞实验等。DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM12三、动物实验设计的原则与方法(一)动物实验设计的基本原则对照(Control)重复(Repeat)随机(Random)DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM131.对照性原则对照组：在实验过程中不施加处理因素(实验因素)的组别。目的：1.消除或减少非实验因素的影响。2.监控实验条件。方式：自体对照、组间对照。类型：阴性对照、阳性对照、溶剂对照DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM14溶剂与助溶剂选择的基本要求1.无毒或实际无毒2.与受试物不起反应，受试物在溶剂中稳定3.对受试物的毒动学与毒效学没有影响4.无刺激性或气味DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM动物实验常用溶剂和赋形剂水：所有途径，首选生理盐水：除皮肤与眼周外，所有的途径乙醇：用于皮肤与经口，经口限量为5ml/kg丙酮：用于皮肤与经口，经口限量为5ml/kgDMSO：用于所有途径，浓度超过5％可增强吸收甘油：用于经口、皮肤、ip、iv(其水溶液)玉米油：用于经口、皮肤、阴道、直肠、皮下聚乙二醇-400：作为助溶剂羧甲基纤维素：0.1～0.5%水溶液，用于经口凡士林：用于皮肤、阴道、直肠15DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM162.重复性原则重复：指精确可靠的实验结果，在相同的条件下的一致性，包含重现性和重复数两方面的含义。目的：估计试验误差、增强样本的代表性、提高实验结果的可信度。如何保证重复：1.严格控制实验条件和可能的干扰因素；2.足够数量的实验动物数。DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM17实验动物样本数的一般估计试验动物资料类型所需动物数目大、小鼠豚鼠犬、猪计量资料计数资料计量资料计数资料计量资料计数资料1030820620DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM183.随机性原则随机：总体中的所有个体被选取的机会均等。在抽样研究中，样本要想能代表总体，一个重要的原则就是随机化，以实现样本较好的代表性。目的：减少或避免主观因素的影响，提高样本的代表性。随机化的方法：抽签法、随机数字表、随机函数DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM19(二)动物实验设计的主要方法1.配对设计：将受试动物按一定条件配成对子，再随机分配每对中的两个受试动物到不同的处理组。2.随机区组设计：将受试动物按一定的特征划分为若干配伍组或区组，再将机每一配伍组中的各受试动物随机分配到不同的处理组。3.完全随机设计：将受试动物随机地分配不同的处理组。4.拉丁方设计：按拉丁方阵型将受试动物随机的分配到各个处理组（涉及多个因素，且各个因素无交互作用、水平数相等）。DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM20PartⅡ.动物试验的基本操作技术DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM21无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求达到：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。健康动物的重要标志如下:1．眼睛：明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物；2．耳：耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮；3．鼻：无喷嚏，无浆性粘液分泌物；4．皮肤：无创伤、无脓疮；疥癣、湿疹；5．颈部：要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物；6．消化道：无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净；7．神经系统：无震颤、麻痹。若动物(大鼠、小鼠)出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动，应放弃该动物；8．四肢及尾、四肢、趾及尾：无红肿及溃疡。(一)健康动物的选择DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM22根据实验要求选择性别，实验如果对性别无特殊要求者，宜选雌雄动物各半。（1）大、小鼠依肛门与生殖孔间的距离区分,间距大者为雄性，小者为雌性。成年雄鼠卧位可见到睾丸，雌性在腹部可见乳头。图1-1雌雄大、小鼠肛门与生殖孔间距离（二）实验动物的性别和日龄鉴定1.实验动物的性别鉴定DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM232.豚鼠：用一只手抓住豚鼠颈部，另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物则显出三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。3.家兔：将家兔头轻轻夹在实验者左腋窝下，左手按住腰背部，右手拉开尾并将尾巴夹在中指和无名指中间，然后用拇指和食指稍稍把生殖器扒开。雄兔即可见到一圆孔中露出圆锥形稍向下弯曲的阴茎(但幼年雄兔看不的阴茎，只能看到圆孔中有凸起物，即是阴茎)。雌兔此处则为一条朝向尾缝，呈椭圆形的间隙，间隙越向下越窄，此即为阴道开口处。图1-2兔雌雄生殖器外形特征与差异DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM24日龄(d)体重(g)初生1.854.0106.01511.02015.02521.03021.0不同日龄KM小鼠的体重2.实验动物(大、小鼠)的日龄鉴定DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM25不同日龄SD大鼠的体重日龄(d)体重(g)初生6-71017-252035-503055-9040100-15050150-21060170-24070210-27080240-320注：１月龄后，雄鼠取上限，雌鼠取下限。DepartmentofHealthToxicologySchoolofPublicHealth,CSU4/17/20209:36AM