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药物排泄的研究进展讲演人：王婷婷2014年4月药物排泄途径转运体的分类肝脏药物转运体研究药物转运体的常用方法文献研究目录（一）药物排泄途径排泄途径排泄物收集法肾脏大鼠代谢笼法、导尿管法、膀胱造瘘法、输尿管法胆汁胆总管插入法乳汁乳头按摩收集唾液腮腺与颌下腺插管收集呼气密封代谢笼吸收剂收集汗腺（二）转运体的分类转运体转运物质典型底物血管侧膜Na+-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)胆汁酸；胆盐；胆汁酸类似物雌酮-3-硫酸有机阴离子转运蛋白（OATs）阴离子化合物、中性类固醇、生理物质(如前列腺素类和甲状腺激素)和某些B类疏水性阳离子前列腺素E2,5-氟尿嘧啶、紫杉酚、茶碱有机阴离子转运多肽（OATPs）雌二醇-17β-葡糖醛酸、雌酮-3-硫酸、罗舒伐他汀、非索非那定、替米沙坦有机阳离子转运蛋白（OCTs）有机阳离子药物及内源性物质(胆碱、胍等)扑热息痛葡萄糖醛酸苷、MPP+、四乙胺、胍丁胺（三）肝脏药物转运体转运体转运物质典型底物胆管侧膜P-糖蛋白(P-gp)脂溶性较高的阳性或中性药物多柔比星、长春新碱、红霉素、塞利洛尔、地西泮等多药耐药相关蛋白2(MRP2)阴离子化合物及共轭代谢物普伐他汀、替莫普利拉、甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂胆酸盐外排转运蛋白（BSEP）未共扼结合的胆酸盐牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、胆酸盐、牛磺石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、牛熊去氧胆酸盐和他莫昔芬乳腺癌耐药蛋白（BCRP）某些药物的胆汁排泄多种抗癌药如甲基蝶呤、多柔比星等（三）肝脏药物转运体一、体内试验基因缺陷动物模型先天遗传性基因缺陷模型基因敲除模型二、体内/体外试验肝脏灌流技术离体肝脏灌流在体肝脏灌流（四）研究肝脏药物转运体的常用方法三、体外试验非洲爪蟾卵母细胞：cRNA注射单转染细胞：HEK293双转染细胞：Hela、MDCK-П、LLC-PK1CMVs（微管膜囊泡）实验四、RT-PCR技术——半定量测蛋白表达WesternBlot技术——定量测蛋白表达（四）研究肝脏药物转运体的常用方法（五）文献研究头孢妥仑（CDRT）胆汁排泄的分子机制及其对肝脏转运蛋白调节作用的研究一、实验目的头孢妥仑转运体(Mrp2、Bcrp或P-gp)？转运头孢妥仑？影响(Mrp2、Bcrp或P-gp)蛋白表达在体肝灌流CDRT+抑制剂CDRT出口灌流液胆汁肝摄取率胆汁累积排泄率抑制剂是否影响肝摄取？转运体参与胆汁排泄大鼠口服不同浓度CDRT一周肝组织总RNART-PCR各转运体mRNA表达情况膜蛋白WesternBlot证实转运蛋白表达情况HPLC二、实验思路三、实验材料实验动物Wistar大鼠，雄性，体重230~250g主要试剂头孢妥仑标准品等主要仪器肝灌流仪，HPLC等肝脏的血液供应非常丰富，接受两种来源的血供。（1）门静脉。主要接受来自胃肠和脾脏的血液；（2）腹腔动脉的分支肝动脉。门静脉与肝动脉进入肝脏后，反复分支，在肝小叶周围形成小叶间动脉和小叶间静脉进入肝血窦中，再经中央静脉注入肝静脉。四、实验方法1.肝灌流实验肝灌流装置=灌流系统+恒温系统+气体交换系统1.1.实验相关溶液的配制(1)抗凝缓冲液的配制枸橼酸三钠15.6g枸椽酸5.7gddH2O600m1(2)磷酸盐缓冲液(PBS)的配制NaCl(58.44)8.0gKCl(74.55)0.2gNa2HPO4.12H2O(358.14)2.9gKH2PO4(136.09)加ddH2O1000ml调pH7.4withHCl(3)灌流缓冲液的配制NaCl(58.44)118mM6.9gKCl(74.55)4.7mM0.35gMgSO4.7H2O(246.27)1.2mM0.30gKH2PO4(136.09)1.2mM0.16gNaHCO3(84.01)25mM2.10gGlu(198.17)5mM0.96gCaCl2(110.99)2.5mM0.28g加ddH2O1000m1调pH7.4withNaOH1.2灌流所需的牛血红细胞制备(1)3L新鲜牛血与600m1抗凝缓冲液混匀，过滤，三层纱布置于大漏斗中。使牛血贴壁流下，以免红细胞因机械外力被破碎;(2)离心,5000rpm,l0min,4℃，将上层的血浆、血小板和白细胞弃去，下层为牛血红细胞;(3)加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),混匀，离心，3000rpm,l0min,4℃，清洗红细胞，弃上清;(4)重复步骤(3)3次，收集下层干净的牛血红细胞，4℃保存，备灌流时使用。1.3.原位肝灌流法(1)灌流室预热，使温度达37℃;将牛血红细胞与灌流缓冲液混匀，使红细胞的终浓度为20%，作为灌流液。设立对照组(头孢妥仑(1uM)和实验组(头孢妥仑(1uM)和不同转运蛋白的特异性抑制剂(20uM))，具体研究如下。把灌流缓冲液和含药的灌流液放入水浴锅中加热至37℃，同时供氧;(2)Wistar雄性大鼠于实验前夜禁食(不禁水)，乌拉坦麻醉，腹部U型开口，将内脏移至右侧，剥离并充分暴露门静脉、下腔静脉、右肾动静脉和胆管;(3)胆管插管，固定，此时可见胆汁缓慢流出;(4)门静脉插管，固定，用预热的灌流缓冲液灌流肝脏，流速为12m1/min;(5)迅速剪断下腔静脉腹腔段，冲去肝脏内原有的血液，结扎右肾动静脉;(6)迅速打开胸腔，右心耳插管，使液体缓慢流出;(7)肝脏平衡l0min后，实验组用含抑制剂((20uM)的灌流液灌流5min，再换含头孢妥仑(1uM)和抑制剂((20uM)的灌流液灌流;对照组用含等体积的抑制剂溶剂的灌流液灌流5min，再换含头孢妥仑((1uM)和等体积的抑制剂溶剂的灌流液灌流肝脏;(8)于0.5、1、3、10、15、20、25、30min收集出口灌流液;(9)于5,15,25min收集胆汁样品;(10)高效液相色谱法测定头孢妥仑含量，考察肝摄取率和胆汁累积排泄率的差别。肝脏摄取率EH=1-Cin/Cout胆汁中药物浓度×胆汁体积灌流液中药物浓度×灌流速度×灌流时间胆汁累积排泄率=1.4.高效液相色谱法测定样品中头孢妥仑的含量(1)色谱条件色谱柱:CapcellpakC18UG1204.6X250mm(日本资生堂);流动相:0.1%醋酸铵:甲醇(65:35);流速:0.8ml/min;检测波长:295nm;进样器温度:4℃;进样体积:25ul(2)出口灌流液样品预处理离心，3000rpm,5min,4℃，取上清液90ul置新的Ep管，加内标(25ug/ml)10ul,混匀，再加入甲醇200u1,混匀，离心12000rpm,15min,4℃。取上清液100u1进样;(3)胆汁样品预处理取胆汁样品10ul，加30u1ddHzO，内标l0ul,混匀，加50u1甲醇，混匀，离心，12000rpm,15min,4℃。取上清液70u1进样。2.头孢妥仑对肝脏Mrp2,Bcrp,P-gp,Oct1和Oat2mRNA表达的影响——RT-PCR3.证实头孢妥仑对肝脏Mrp2蛋白表达情况——WesternBlot五、实验结果1.肝灌流实验1.1肝摄取率加入抑制剂不影响CDRT的肝摄取1.2胆汁累积排泄率Mrp2和Bcrp参与CDRT胆汁排泄P-gp不参与2.RT-PCRMrp2、Bcrp和Oat2的mRNA上调P-gp和Oct1的mRNA下调3.WesternBlotCDRT对Mrp2蛋白表达的影响有剂量依赖性谢谢大家！2014年4月