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使用RNAscope技术探索HBVDNA，cccDNA以及mRNA在肝组织中的分布简介HBV的感染侵入病人体内细胞后，其内含的HBV-DNA脱离包裹的蛋白质被释放形成rcDNA，依赖宿主的DNA聚合酶补齐形成更加稳定的cccDNA，并以cccDNA作为模板转录出不同大小的mRNA，作为各种抗原蛋白以及HBV-DNA的逆转录模板。基于各类核酸不同但同样重要的作用，本项目旨在用一种新型的RNAISH技术RNAscope@来标定HBV-DNA，cccDNA，mRNA，探索各类核酸在乙肝病人组织中的差异分布，并比较在乙肝病人四个发展阶段（immunotolerant,immuneactive,inactivecarrier,andHBeAg-negativehepatitis）的不同变化，以及INF治疗效果不同病人之间的差异变化。本项目有助于我们进一步了解HBV传播的机制，为HBV的治疗提供指导。背景HBVcccDNA的形成HBV侵入人的肝细胞,在细胞质中脱去核壳,形成rcDNA。rcDNA进入肝细胞核中解脱正链3′端连接的末端蛋白、负链5′端的RNA残段（图一）;依赖宿主细胞的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA,并以cccDNA为模板转录为不同大小的mRNA(3.5Kb、2.4Kb、2.1Kb、0.8KbmRNA),从而翻译各种病毒蛋白。其中3,5Kb的pgRNA作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA,再以负链DNA作为模板,通过病毒DNA聚合酶的作用,合成正链DNA,与负链DNA一起组成新的HBVrcDNA。新合成的HBVrcDNA一方面进入细胞核内,转化为新的cccDNA,补充细胞内的cccD2NA库,使每个肝细胞中保持大约5～50个cccDNA分子;另一方面与病毒蛋白装配成新的完整HBV,释放至细胞外,再感染健康的肝细胞(见图1)[1]。InHBVgenome,theincompleteplusstrandhasavariable3‘-endbutadefined5’-endaroundposition1600nearDR2,whilethecompleteminusstrandhasdefined5‘-and3’-endswithaterminalredundancyof9bases[27].Thereisagaparoundposition1800nearDR1(Fig.1).图一HBV基因组结构。HBV基因组有部分单链，部分双链，以及部分的三DNA链在病毒粒子中。各HBV正义链的长度会有很大的不同，但是负义链有固定的5‘-和3’-端靠近1800左右的位置。圆圈，引物酶；钻石圈，DNA聚合酶。2.传统HBVcccDNA的常用检测方法根据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同,可以建立检测cccDNA的方法:(1)rcDNA能与蛋白质共价结合,cccDNA则不能。(2)rcDNA的双链是不对称的,全长的一链与病毒mRNA互补,为负链,较短的一链为正链。在正链和负链上均存在缺口,两链DNA通过5′端250～300个互补碱基的氢键作用形成部分环状结构,而非超螺旋结构;cccDNA的两条链均是完整的,形成超螺旋结构。(3)由于正链和负链上均有缺口存在,rcDNA可以被一些能够切除单链或含有缺口DNA的核酸酶如Plasmid2SafeTMATP2dependentDNase、绿豆核酸酶(mungbeannuclease)等降解成寡核苷酸或单核苷酸,而cccDNA则由于双链结构完整,不会被上述酶降解[2,3]。(一)SouthernblotHBVcccDNA以往多用Southernblot方法进行检测,该方法是分子生物学的经典方法,但对操作者的技术要求较高,且步骤繁琐,灵敏度较低[4]。图二Primerselection.PCRwasperformedtoselectprimerpairswhichcanspecificallyamplifyDNAfragmentfromHBVcccDNAbutnotgenomicDNAinthePCR.The106copiesofcccDNAfromaplasmidcontainingHBVgenomewereusedastemplateinlane1,2,3,7,8,9,13,14,and15;while1.6×106copiesofvirusDNAisolatedfromHepAD38conditionmediumwereusedastemplateinlane4,5,6,10,11,12,16,17,and18.Primerpairs:1,4,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R1;2,5,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R2;3,6,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R3;7,10,HBVCCCF2/HBV_CCC_R1;8,11,HBVCCCF2=HBV_CCC_R2;9,12,HBVCCCF2=HBVCCCR3;13,16,HBVCCCF3=HBVCCCR1;14,17,HBVCCCF3=HBVCCCR2;15,18,HBVCCCF3=HBVCCCR3.HBV_CCC_F1:5’-ACTCTTGGACTCBCAGCAATG-3’;HBV_CCC_F2:5’-TGTTCACCAGCACCATGC-3’;HBV_CCC_F3:5’-GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-3’;HBV_CCC_R1:5’-CTTTATACGGGTCAATGTCCA-3’;HBV_CCC_R2:5’-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3’;HBV_CCC_R3:5’-GTCCATGCCCCAAAGCCACC-3’.(二)普通PCR基于rcDNA的正链和负链上均存在缺口,故可以设计跨越两个缺口的引物,使rcDNA不被扩增,cccDNA由于有完整的双链可以被有选择地扩增[2,3]。(三)Real-TimequantitativePCRHe等[3]建立了实时荧光定量检测cccDNA的方法。他们将具有发光基团和淬灭集团的TaqMan探针设计于负链缺口的下游,与负链互补。在上游引物的引导下,若负链是完整的,Taq酶则到达Taq2Man探针所结合的位点,利用其5′→3′的外切酶活性将探针切断,从而3′端的淬灭集团失去对5′端发光集团的抑制作用,产生荧光信号。若负链含有缺口,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口,故不能产生荧光信号。这样,cccDNA和rcDNA得以区分开来。此方法变普通PCR法的终点监测为实时动态检测,不需对PCR反应产物进行开盖检测,从而减少了PCR产物污染的可能(见图3)。图三RT-qRCR检测cccDNA（四）入侵检查（InvaderAssay）入侵检查是近年来刚开始应用的技术。其基本原理是目标DNA设计一对探针,一个探针称为初始探针(primaryprobe),另一个称为入侵探针(invaderprobe),初始探针的5′端一段寡核苷酸序列不与目标DNA互补,入侵探针3′末端的单个碱基不与目标DNA互补，Flap核酸内切酶I（FlapendonucleaseI）将初始探针5‘端不与目标DNA互补的寡核苷酸序列剪切下来，之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)探针相结合,从而产生荧光信号,能够被实时荧光PCR仪器检测[5]。DKHW等[6]根据此原理,分别设计了与HBVDR2区正链下游、负链上游相结合的两种入侵探针,这样当正链、负链均为完整时产生两种荧光信号,从而检测cccDNA;rcDNA由于正链含有缺口,只能产生一种荧光信号,得以和cccDNA相区分(见图4,5)。整合型HBVDNA在DR2区的5′端也是一段完整的序列,但整合多发生在112bp的DR区[6,7],WongDK等[6]据此认为用入侵检查技术测到整合型HBVDNA的几率应该很低。图四入侵检测技术原理示意图图五入侵检查检测cccDNA（五）最新型的RNAscope技术RNAscope®专利技术是近年来最火的RNA原位杂交技术，是RNA原位杂交（ISH）领域的一项重大进步。由AdvancedCellDiagnostics公司（Newark,CA）开发，通过专利的双“Z”探针设计和信号放大系统，使RNA原位杂交具有高度特异性、单分子检测的敏感性并有极高的信噪比，能够在单细胞水平同时定量多个RNA的表达，在获得单细胞中单拷贝RNA表达数据的同时提供完整的组织形态学信息。袁正洪教授[8]团队利用RNAScope®技术根据HBV各核酸的特点设计了3组探针可以分别识别HBV的totalDNA，cccDNA，mRNA（图六），但是效果还有待评估，特别是免疫染色印迹法标记HBVHBsAg抗原和HBVRNA重合度很差，并不符合RNA与蛋白之间的表达关系。图六探针组1与HBV正义链（nt1930-2900）互补，可以和HBVDNA的正链以及pgRNA杂交探针组2与HBV负义链（nt2957-837）互补，只和HBVDNA结合探针组3对应HBV正链的缺失段（nt1090-1690），与HBV-DNA负链互补，使用RNAse去除mRNA后可以专门用于检测cccDNA。图七免疫染色印迹法标记HBVHBsAg抗原和HBVRNA重合度很差实验目的目的一，利用RNAScope®技术设计两套与袁正洪教授组不同的HBV1b和HBV2a的DNA，cccDNA，mRNA探针，并与袁正洪教授组的结果相比较目的二探索各核酸在乙肝病人肝组织内各个不同时期的分布目的三对比IFN治疗反应不同病人之间各核酸表达与分布的不同Reference1.SeegerC,MasonWS(2000)HepatitisBVirusBiology.Microbiology&MolecularBiologyReviews64:51.2.AddisonWR,WaltersKA,WongWW,WilsonJS,MadejD,etal.(2002)Half-LifeoftheDuckHepatitisBVirusCovalentlyClosedCircularDNAPoolInVivofollowingInhibitionofViralReplication.JournalofVirology76:6356-6363.3.HeML,WuJ,ChenY,LinMC,LauGK,etal.(2002)AnewandsensitivemethodforthequantificationofHBVcccDNAbyreal-timePCR.Biochemical&BiophysicalResearchCommunications295:1102.4.LiXM,YangYB,HouHY,ShiZJ,ShenHM,etal.(2003)InterruptionofHBVintrauterinetransmission:aclinicalstudy.Worldjournalofgastroenterology9:1501.5.KwiatkowskiRW,LyamichevV,DeAM,NeriB(1999)Clinical,genetic,andpharmacogeneticapplicationsoftheInvaderassay.MolecularDiagnosis4:353-364.6.WongDK,YuenMF,YuanH,SumSS,HuiCK,etal.(2004)QuantitationofcovalentlyclosedcircularhepatitisBvirusDNAinchronichepatitisBpatients.Hepatology40:727.7.MasonAL,XuL,GuoL,KuhnsM,PerrilloRP(1998)Molecularbasisforpersistenthepat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