糖脂代谢稳态调控的分子机制

项目名称：糖脂代谢稳态调控的分子机制首席科学家：林圣彩厦门大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标1.总体目标确定机体和细胞在不同生理状况和环境因素下维持糖脂代谢稳态的分子机制，阐明在细胞生长和应激反应中起重要作用的调节因子调控细胞代谢的信号通路网络，为糖脂代谢紊乱造成的肥胖、脂肪肝、糖尿病和癌症的早期诊断和治疗提供理论依据。2.五年预期目标(1)建立对实验动物代谢相关的生理生化指标分析的技术平台，发现相关基因敲除或转基因小鼠造成糖脂代谢紊乱的信号通路。(2)较系统地描述在逆境下机体和细胞调控糖脂代谢的分子网络以及调控过程中关键蛋白质和蛋白质复合体的动态调控机制。(3)发现新的参与代谢调控的基因，为代谢性疾病和肿瘤的防治提供新的分子靶标。(4)培养高质量博士研究生20-30名，培养3-5名享有国际知名度的专家和5-8名中青年学术带头人。(5)在国际重要刊物发表SCI论文15-25篇，其中争取在Cell、Nature、Science或其子刊等影响因子10以上杂志发表研究论文5-10篇，申请发明专利3-5项。三、研究方案1.总体研究方案细胞能量代谢是细胞最基本、最重要的活动之一，与细胞的繁殖、分化、凋亡、运动、信号转导及多种重要疾病的发生密切相关，是生命科学的一个重要领域。细胞要通过能量感应系统随时监测其能量水平状态，在不同的物质和能量状态下要不断地通过细胞内的代谢调控途径来调节其代谢水平以达到一种稳态。同时，细胞在面对内外界一些不良因素时也会做出相应的代谢变化，这些应激反应对细胞正常的生长和功能是极其重要的。如果这些应激反应失调，就会使细胞代谢发生异变，导致如前所述的多种人类重大疾病的发生。本项目的总体研究方案拟利用我们在蛋白质科学、细胞代谢、细胞信号转导等研究领域的研究优势和技术手段，结合细胞生物学、动物生理学等学科的研究方法，集中力量多层次、多角度地研究与细胞代谢调控相关的信号通路网络，分离和鉴定参与细胞代谢调控的新的基因和信号通路，探讨各个信号通路之间的动态调控机制，并研究细胞异常代谢的信号通路，揭示代谢异常与糖尿病、肿瘤等重大疾病的关系。项目总体研究方案如下图1：内外环境因素（缺氧、营养缺乏或过剩、癌基因突变等）糖代谢（转运、酵解、储存、异生等）应激反应因子(p53、AMPK、HIF1等)脂代谢（储存、分解、分泌等）糖脂转运调控因子(Glu4、Tankyrase、Cide等)细胞生长调节因子(Wnt、TR3、ckip-1等)内外环境因素（缺氧、营养缺乏或过剩、癌基因突变等）糖代谢（转运、酵解、储存、异生等）应激反应因子(p53、AMPK、HIF1等)脂代谢（储存、分解、分泌等）糖脂转运调控因子(Glu4、Tankyrase、Cide等)细胞生长调节因子(Wnt、TR3、ckip-1等)图1.项目总体研究方案2．技术路线由于代谢调控常常涉及多种组织、器官乃至整个机体，因此利用基因敲除小鼠模型来确证基因在代谢过程中的生理功能已成为“金标准”。本项目组已经拥有或正在构建各种基因敲除小鼠和转基因小鼠模型，包括TNKS2、PTEN、CKIP-1、cideb、p53、Lkb1、Tip60基因敲除小鼠以及cidea转基因小鼠。我们将利用这些小鼠模型，比较研究代谢调控在正常生理状况以及不同内外因素的刺激下细胞能量代谢的变化及其调控的信号通路网络。同时，我们也将借助体外细胞培养，特别是比较研究正常细胞以及肿瘤细胞在低氧状况下和目前常规培养状况下代谢调控的异同，并与机体内生理条件下代谢调控的情况相比较，寻找适合代谢调控研究的细胞培养模型。在此基础上验证从动物模型得到的结果，并在分子水平上进一步深入研究影响细胞代谢的信号通路网络和调控机制。此外，我们将通过酵母双杂交、分子筛层析、免疫共沉淀和质谱等等蛋白质研究手段捕捉并鉴定与代谢调控相关的蛋白质复合体及其组份，从而为阐明代谢调控中各种蛋白质复合体的动态组装奠定基础。同时，利用蛋白质结构解析来揭示各种蛋白质复合体中蛋白质的相互作用关系。故，项目的总体技术路线如图2：逆境状况正常生理状况动物模型(小鼠、大鼠)细胞水平(细胞培养)细胞能量代谢调控信号网络代谢的调控机制课题1/2/3课题2/1/3分子水平(蛋白质功能、复合体及结构分析)逆境状况正常生理状况动物模型(小鼠、大鼠)细胞水平(细胞培养)细胞能量代谢调控信号网络代谢的调控机制课题1/2/3课题2/1/3分子水平(蛋白质功能、复合体及结构分析)图2.项目的总体技术路线3.创新与特色本项目拟利用已有或正在进行的各种基因敲除小鼠模型，在动物个体的基础上阐明代谢调控的机理和生理作用。同时，借助我们在脂质组学、代谢组学、蛋白质组学、功能基因组学方面的研究基础和优势，对调控糖脂代谢稳态的分子机制进行研究，探索细胞在不同逆境（低氧、缺氧、高脂等）下的代谢方式的转变及其调控信号通路网络的动态变化，特别是深入探讨细胞生长和应激反应的重要调节因子对细胞代谢的调控作用，将在分子水平、细胞水平以及动物个体水平上增进我们对代谢调控以及异常代谢与细胞异常增殖之间的关系的认识。为最终阐明细胞糖脂代谢稳态调控的分子机制和相关重大疾病的防治提供理论基础。4．课题设置课题1糖脂转运及其稳态调控的的分子机制研究内容：细胞内糖脂代谢的稳态调控是维持细胞或机体基本生命活动的基础，糖脂代谢的紊乱与糖尿病、肥胖、脂肪肝、心血管疾病、细胞异常增殖以及癌症的发生和发展密切相关。本课题将在分子、细胞和基因敲除小鼠水平上研究Axin、AMPK、TNKS2、PTEN、Cideb、Cidea等基因对葡萄糖转运、脂肪合成和储存、脂滴的形成等代谢途径的调节作用及其与肥胖症、脂肪肝和细胞异常增殖的关系。从细胞学的角度来看，肥胖的发生是由于脂肪细胞数量的增加以及脂肪细胞中脂滴变大两个方面引起的。研究表明，伴随着脂滴的变大，脂肪细胞变大，导致细胞炎症因子分泌的变化，例如resistin、TNFα和游离脂肪酸等分泌的增加，最终导致机体内胰岛素抵抗和糖尿病的发生。因此，对脂滴的形成过程的研究，不仅有助于我们了解脂滴的生物学功能，而且对肥胖及肥胖引起的其它代谢综合症疾病，有深远意义。课题1拟开展以下几个方面的研究：1.糖代谢的稳态调控通过前期工作，我们发现Axin和AMPK能相互作用并增强AMPK响应能量缺失的刺激，即AMPKα的第172位苏氨酸的磷酸化。Axin敲低的细胞在受到低糖刺激的情况下，AMPKa的第172位苏氨酸的磷酸化水平增加幅度与正常细胞相比大幅降低。这表明Axin是应对糖稳态变化的重要因子，且在AMPK活性调控的过程中扮演了重要角色。我们拟进行以下实验，深入阐明Axin、AMPK和糖稳态调控的关系：(1)研究Axin调控AMPK活性的分子机制研究Axin调节AMPK的激活是通过影响AMPK上游激酶与AMPK的相互作用还是影响了AMPK三个亚基之间的相互作用。(2)应用小鼠模型研究Axin缺失或突变导致的AMPK活性的变化利用腺病毒感染系统特异性地敲低小鼠肝脏或肌肉中的Axin，或利用条件性基因敲除技术敲除小鼠肝脏或肌中的Axin，对这些小鼠施以饥饿等影响能量水平的刺激，观察动物体内AMPK活性的变化。(3)应用小鼠模型研究Axin缺失或突变导致的糖稳态平衡的改变对上述小鼠进行糖代谢相关生化指标的测定以及AMPK参与糖代谢相关基因的表达水平的检测。(4)研究Aurora在Axin调控AMPK活性中的作用Aurora是在生长中起重要作用的激酶，能调控Axin在中心粒上的定位，因此，我们拟研究Aurora是否在Axin调控AMPK活性中也起作用。2.研究葡萄糖转运和脂肪细胞生成的分子机制以及糖脂代谢异常与肥胖和胰岛素抵抗的关系(1)研究Axin和TNKS2对葡萄糖转运的调节机理我们通过酵母双杂交实验发现Axin能与TNKS2相互作用；TNKS2与Kif3a之间相互作用；Axin与Kif3a之间也存在相互作用。Kif3是由Kif3a、Kif3b和KAP3构成的异源三聚体。它是一种依赖于微管的马达动力蛋白质复合体，可以向微管正极定向移动，在细胞内承担膜性细胞器或生物大分子复合物的运输功能。已有的研究表明在3T3-L1脂肪细胞中Kif3参与胰岛素调节的Glut4向细胞膜的转运。TNKS2与GSV(Glut4storagevesicle)上的IRAP有相互作用。我们将通过免疫荧光实验确定Kif3a、TNKS2、Axin和Glut4之间是否有共定位，而且在胰岛素刺激下是否有向细胞膜共转移的现象。同时，我们将用siRNA干扰C2C12细胞中TNKS2、Axin及Kif3a的表达，观察细胞对胰岛素刺激下葡萄糖吸收的反应。另外，用TNKS2抑制剂XAV939（由厦门大学生命科学学院沈月毛教授合成）刺激C2C12细胞，观察该抑制剂是否能降低胰岛素刺激引起的葡萄糖的吸收。通过上述实验我们将证明Kif3a、TNKS2、Axin是否通过形成复合体来调控胰岛素刺激的Glut4的转运，从而调节葡萄糖的吸收。(2)分离TNKS2的新的蛋白质复合体为了更全面的找到以TNKS2为核心的调节糖脂代谢的分子网络，我们拟构建TNKS2不同片段的饵，使其覆盖TNKS2全蛋白质序列，进行大规模的酵母双杂交实验。另一方面，我们拟以小鼠的肌肉、脂肪组织为原料，采用以高效液相色谱为核心的生化分离手段结合蛋白质谱分析技术，分离鉴定出不同生理水平下TNKS2复合体中的蛋白质组份，并用免疫共沉淀、免疫荧光共定位及GST-pulldown等方法进一步验证这些蛋白质与TNKS2的相互作用。(3)研究TNKS2的多聚ADP核糖化酶活性在调节葡萄糖转运及脂肪细胞生成中的作用。首先我们将通过质谱手段检测胰岛素是否调控TNKS2的翻译后修饰，进而研究该修饰是否影响TNKS2的多聚ADP核糖化酶的活性及TNKS2和其相互作用蛋白质的结合。此外，由于TNKS2具有多聚ADP核糖化酶的活性，我们将考察TNKS2是否介导与其相互作用的蛋白质的多聚ADP核糖化修饰。在此基础上我们将构建TNKS2的多聚ADP核糖化酶活性缺失的表达载体，研究其形成复合体的能力及调节葡萄糖转运和脂肪细胞生成的作用。(4)在动物水平上研究调控葡萄糖转运及脂肪细胞生成的分子机制。全面分析TNKS2基因敲除小鼠与代谢相关的表型，包括小鼠在不同生长时期、不同生长条件（饥饿或饱食、缺氧等）下的体重、体温、不同部位脂肪组织的重量和脂肪细胞的数量、内脏器官的重量等。同时测定小鼠血液中血糖、甘油三酯、不饱和脂肪酸、胰岛素、胰高血糖素及瘦素的含量；脂肪组织中脂肪的含量；肝脏和肌肉中糖原的含量等。此外，对小鼠进行葡萄糖耐受试验、丙酮酸耐受试验及胰岛素耐受试验，测定小鼠脂肪和肌肉的葡萄糖吸收效率。由于腺病毒感染系统可以特异性地攻击肝脏和肌肉，我们将利用该系统在小鼠的肝脏和肌肉中导入针对Axin及上述新发现的TNKS2的复合体的组份的siRNA，测定小鼠与代谢相关的表型，确定这些分子及其复合体在调控葡萄糖转运及脂肪细胞生成中的作用。同时，我们将建立上述基因的条件性敲除或敲入小鼠，分析这些小鼠与糖脂代谢相关的表型，为分子及细胞水平的研究结果提供生理证据。另一方面，我们拟与厦门大学附属第一医院合作，在肥胖症、糖尿病等代谢相关疾病的病人中检测脂肪组织中TNKS2的表达及基因突变情况，以期为代谢相关性疾病的早期分子诊断提供依据。3.脂代谢稳态调控的机制研究Cide家族蛋白质（Cidea，Cideb和Fsp27），PTEN和AMPK在脂肪细胞和肝细胞中脂代谢稳态包括脂储存，脂分解和分泌中的作用，运用转基因和基因敲除模型在动物水平上研究脂代谢与脂肪肝发生，肝组织纤维化，炎症反应，细胞异常增殖之间关系。(1)Cide家族蛋白质在脂肪细胞中脂滴形成、融合与水解的作用及其机制我们通过Fsp27基因敲除小鼠，小鼠胚胎纤维细胞和脂肪细胞株3T3-L1的研究表明Fsp27蛋白质定位于脂滴表面，可控制脂肪细胞中脂滴的形成，脂水解，并在脂肪细胞中基因表达调控以及胰岛素的敏感性中起重要作用。但其作用的分子机