CHAPTER-3-转录

转录(transcription)－从DNA到RNAChapter3OUTLINE3.1转录过程的概述3.2转录机器的主要成分：RNA聚合酶和转录复合物3.3原核生物基因的转录3.4真核生物基因的转录基因表达基因表达包括：转录和翻译转录：拷贝出一条与DNA序列完全相同的RNA单链的过程，由RNA聚合酶催化，通过互补碱基配对来合成RNA。翻译：以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联体密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽的过程。编码链(codingstrand,有义链sensestrand)：与mRNA序列相同的DNA链。模板链(templatestrand,反义链antisensestrand)：根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链。有义链和反义链基因转录为RNAmRNA(messenger)：编码特定蛋白质序列tRNA(transfer)：特异性解读mRNA中的遗传信息，将其转化为相应氨基酸后加入多肽链中rRNA(ribosomal)：直接参与核糖体中蛋白质合成RNA3.1RNA转录概述转录的基本过程：1.转录起始(模板识别、启动子选择、通过启动子)2.转录延伸3.转录终止三种RNA-tRNA、rRNA、mRNA都由基因转录而成，然后mRNA翻译成蛋白质，最后组装成功能蛋白。RNA的转录1.转录起始于RNA聚合酶和启动子(promoter)结合之后，转录起始的第一个碱基称为转录起始点(startpoint)。在RNA聚合酶的作用下合成RNA，至终止子(terminator)终止。2.由启动子到终止子之间的序列称为转录单位(transcriptionunit)。转录起始点前面的序列称为上游(upstream)，后面的序列称为下游(downstream)。与转录有关的一些概念与转录有关的一些概念RNA聚合酶RNA聚合酶3.1.1模板识别和转录起始是RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核酸与模板DNA的碱基配对。转录的起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。通过启动子阶段①转录后形成9个核苷酸短链，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生RNA链与DNA模板链结合不够牢固，容易掉下导致转录重新开始。②RNA聚合酶合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入延伸阶段。3.1.2转录的延伸①RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程。(底物核苷酸加入到生长的多核苷酸的3‘端)②随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’末端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。3.1.3转录的终止当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来。3.2转录机器的主要成分RNA聚合酶：依赖于DNA的RNA聚合酶；以DNA为模板、4种核苷三磷酸为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，不需要引物。3.2.1大肠杆菌RNA聚合酶聚合酶全酶：由5类亚基构成，包括αββ’ω和σ亚基，相对分子质量4.65×105。核心酶：2个α,1个β,1个β’,1个ω。α亚基的功能是结合启动子。β和β’组成聚合酶的催化中心。σ亚基的功能是识别启动子，无催化活性。大肠杆菌RNA聚合酶核心酶催化中心大肠杆菌RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶3.2.2真核生物RNA聚合酶三类RNA聚合酶(I转录rRNA,II转录mRNA,III转录5SrRNA和tRNA)在细胞核中位置不同，转录基因不同。一般8－14个亚基，相对分子量超过5×105。遵循两个原则：一是有两个相对分子量超过1×105的大亚基，二是有几个小亚基为III类或II类聚合酶所共有。真核生物RNA聚合酶II合成RNA的主要酶类，与mRNA前体hnRNA(HeterogeneousnuclearRNA,核不均一RNA)合成有关。分子量500-600kd，两个大亚基和若干小亚基。真核生物RNA聚合酶II的大亚基最大亚基分子量约220－240kD，能被磷酸化，依赖于启动子结合DNA模板，占酶II分子量的40％，与E.coli的β’亚基具有高度同源性。次大亚基分子量140－150kD，不能被磷酸化，可能与DNA模板、新生RNA链和底物NTP结合，参与磷酸二酯键的形成，功能上同于细菌RNA聚合酶的β亚基。真核生物RNA聚合酶II的小亚基有6－10种，分为三类：3种RNA聚合酶所共有，与DNA结合有关；只在RNA聚合酶II中发现；在某些条件下可以去掉的亚基，参与酶的基本结构。真核生物RNA聚合酶I位于核仁，与rRNA合成有关；分子量约500－600kD，有6－13种亚基；最大的两个亚基分子量分别为190kD和135kD。真核生物RNA聚合酶I的亚基最大亚基约由1670个氨基酸残基组成，主要功能是结合DNA模板和新生的RNA链，参与转录的延伸；次大亚基可以结合DNA模板和新生的RNA链，也结合NTP，参与转录的起始和延伸过程；小亚基为酶的装配所必须，或者具有结合DNA模板的序列结构。真核生物RNA聚合酶III含锌蛋白质，通常由9－15种亚基组成，分子量约600－700kD，主要负责合成5SrRNA，tRNA；酵母RNAPIII的最大亚基160kD，含有结合DNA模板的锌指结构；次大亚基128kD具有结合锌和NTP的两种位点，参与转录的起始、延伸和终止。ComparisonofeukaryoticandprokaryoticRNApolymerasesEukaryotes:Threepolymerasetranscribesdifferentclassofgenes:PolI-largerRNAgenes;PolII-mRNAgenes;PolIII-tRNA,5SrRNAandsmallnuclearRNAgenes.Prokaryotes:onepolymerasetranscribesallgenes.3.3原核生物基因的转录1.转录的起始(启动子的结构，RNA聚合酶识别、结合启动子等)2.转录的延伸(形成RNA聚合酶-新生RNA链-DNA模板三元复合物)3.转录的终止(终止子及转录终止的辅助因子ρ蛋白)原核生物基因转录过程1、启动子的基本结构启动子：是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合，并具有转录起始的特异性。转录单元(unit)：是一段从启动子(promoter)开始至终止子(terminator)结束的DNA序列。1、启动子的基本结构转录起点：是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，通常为嘌呤上游：起点前面5’末端的序列下游：起点后面3’末端的序列转录起点为+1，上游依次为-1，-2；下游依次为+2，+3。典型启动子的结构-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT3’5’DNA转录起始点Pribnow盒子启动子3510+1转录区5’3’RNA转录起点与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。2、原核生物基因启动子的结构一般长20-200bp，含最保守的两个区域：(1)Pribnow框(-10区)：在转录开始位点上游-10区的6bp序列TATAAT；决定转录方向，酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物。RNA聚合酶的结合诱导Pribnow框双链的解开，然后扩大到17个核苷酸长度的泡状物，此时酶与启动子序列形成开放启动子复合物，在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。2、原核生物基因启动子的结构(2)-35区：在转录开始位点上游-35区的一段保守序列TTGACA；其功能：是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点，对RNA聚合酶全酶具有很高的亲和性。2、原核生物基因启动子的结构-10区与-35区之间的最佳间距：一般在16－19bp，小于15bp或者大于20bp都会降低启动子的活性。两种启动子突变：下降突变：Pribnow框的TATAAT变为AATAAT就会降低转录水平；上升突变：增加Pribnow框共同序列的同一性就会提高转录水平。2、原核生物基因启动子的结构(3)CAP结合位点：在某些操纵子中，除调节基因所产生的阻遏蛋白与操纵基因(O)结合，对操纵子的结构基因实行负调控之外，还有正调控机制。负调控：大肠杆菌在含有乳糖和葡萄糖的培养基中，优先利用葡萄糖，阻遏lac操纵子基因的表达；葡萄糖效应(正调控)：在葡萄糖减少时，腺苷酸环化酶ACase使ATP转变为cAMP(环腺嘌呤核苷酸)。cAMP与其效应蛋白(代谢物激活蛋白)CAP结合成复合物，然后与lac启动子上的CAP位点结合，这样lac启动子被正调控因子活化，继而被RNA聚合酶识别。原核生物基因的正调控lac启动子上有两个CAP结合位点：位点I位于-70—-50，有反向重复序列，位点II位于-50—-40；cAMP-CAP复合物首先结合于位点I，从而提高了位点II结合cAMP-CAP的能力(协同效应)；一旦位点II被cAMP-CAP占据，RNA聚合酶很快识别、接触-35区，然后再与-10区结合。原核生物启动子CAP结合位点3、增强子及其功能增强子：强化转录起始的序列，能增强或促进转录的起始，除去这段序列会大大降低转录水平，保留其中一段或插入至DNA分子的其它部位，可以保持基因的正常转录。如SV40：转录起始位点上游200bp处的两段72bp长的重复序列。增强子作用机理作用机理：可能通过影响染色体DNA-PROTEIN结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合。四个阶段：1.识别。核心酶在σ因子参与下接触和识别DNA启动子区域（-35区）。2.结合。完成从非特异性结合转变为特异性结合的过程；RNA聚合酶（α亚基）与启动子（-10区）特异性结合，形成封闭起始复合物。3.3.1原核生物基因转录的起始RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合3.从封闭性转变为开放性起始复合物。酶结合在-10区时，启动子活化，并解开双链结构，暴露模板链；4.形成三元起始复合物。酶移动到转录起始位点，在起始位点加上第一个核苷三磷酸，转录开始。原核生物基因转录的起始①使RNA聚合酶识别启动子。保证RNA聚合酶特异性、稳定地结合到基因的启动子序列上，而不结合到其它非特异性、低亲和性的位点上。②使RNA聚合酶特异性结合启动子。RNA聚合酶全酶首先进入自由卷曲的DNA作迅速的相对运动，与非特异性位点相遇，通过接触、解离、再接触，沿DNA链迅速移动，酶分子在DNA上搜索启动子，当σ因子发现其识别位点时，全酶就与-35区结合。1、σ因子的作用①RNA聚合酶结合在转录起始位点上游-50-+20附近的一段DNA区域。②σ因子帮助发现其识别位点，全酶就与-35区接触(初始结合)，形成封闭型启动子复合物。2、RNA聚合酶与启动子的结合③全酶一端与-35区接触，另一端可以达到-10区，整个分子向-10区移动，并与之牢固结合，然后在-10区及起始位点处发生局部解链，这时全酶与启动子复合物形成开放型启动子复合物。2、RNA聚合酶与启动子的结合-35区的功能主要是提供RNA聚合酶的识别信号，寻找启动子并形成松散结合的封闭型复合物；-10区的功能主要是使启动子复合物从封闭型转变为开放型，RNA聚合酶在开放型复合物中更紧密地结合成二元复合物。3、由封闭型复合物转变为开放型复合物DNA从-10区向转录起始位点发生局部解链，形成17个核苷酸的开链区；DNA开链是正确引入核苷酸底物的必要条件，这时第一个底物NTP依靠与模板链的互补原则进入β亚基（催化活性中心）中起始位点部位。4、第一个被转录碱基的选择和三元起始复合物转录起始位