MoFlo-XDP-流式细胞仪简要操作步骤-培训手册-v-2

BeckmanCoulter公司MoFloXDP培训材料一、培训大纲二、仪器简介和用途三、适用范围四、样本制备方法推荐五、软件常用操作步骤六、分选高级技巧七、触摸屏界面八、开机、光路和流路检查和清洗九、分选设置所有操作步骤和界面说明请参看INSTRUCTIONFORUSE联系方式报修电话：[phone]应用技术支持：游东生13636440348维修技术支持：张洪涛13601981302贝克曼库尔特商贸中国有限公司总机：021-38651000，传真：[phone]福山路500号城建国际中心1201，1208-1210室MofloXDP用户培训大纲装机培训目的z掌握MoFloXDP流式细胞仪分选系统的原理和结构z掌握流式细胞术标记原理和方法，掌握样本制备流程z掌握MoFloXDP开关机程序及常规保养z掌握Summit软件获取、分析、分选方法z掌握MoFloXDP光路检查和调节z掌握MoFloXDP分选设置和分选操作培训内容及时间安排第一天：1，MoFloXDP流式细胞分选系统的原理和结构¾分析和分选原理¾MoFloXDP的结构和特点2，MoFloXDP开关机和保养¾开关机程序¾消毒程序¾鞘液和废液更换方法3，Summit软件介绍¾建立数据库¾菜单¾方案建立¾调取文件分析4，光路检查¾准备微球¾结果判定5，细胞标记和检测¾抗体介绍¾抗体标记的策略和方法¾溶血¾设门和建立逻辑关系¾单色及多色标记的电压和补偿设置¾检测结果解读¾图形和数据输出第二天：6，分选设置和细胞分选¾液滴形成¾分选流路¾液滴延迟时间确定¾分选逻辑选择和设立¾分选细胞收集¾分选统计结果解读¾纯度测定¾克隆分选第三天：7，光路校正¾激光器光路¾流动池位置¾更换流动池¾鞘液压力调节¾激光延迟校正8，克隆分选¾孔板分选¾玻片分选第四天：9，全部过程练习10，答疑11，培训测试仪器简介和用途一、仪器简介和用途BeckmanCoulter公司MoFloXDP是世界上顶级的高速分选型流式细胞仪，可以对样本中特定的细胞进行定量（所占百分比、单细胞表面相对蛋白表达强度等），并对目标细胞进行分选纯化（据标记情况可达99%以上的纯度）。分选纯化后的细胞活性高，细胞状态好，可进行下游的细胞培养、功能测定、动物试验和RNA/DNA/蛋白抽提等工作。MoFloXDP可对样本中任意含量的目标细胞进行分析和分选（国内应用的下限目前低至十万分之一的目标细胞），样本单次获取和保存的细胞量可高达10亿个。分选速度为70000细胞/秒时仍保持高纯度，硬件丢弃（HardAbort或ElectronicAbort）的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。MoFloXDP配置为：z激光系统„488nm氩离子固体激光，-200mW„UV（355nm）固体激光，100mW„635nm氦氖激光，25mW„其它激光器（可选）z滤光片系统„488nm激光：FSC/SSC/525nm/575nm/620nm/675nm/770nm„UV激光：450nm/675LongPass„635nm激光：670nm/750LP„其它激光器滤光片z喷嘴大小：70um，100um或其它大小喷嘴z样本上样管适配器：0.5ml离心管，1.5ml离心管，12mmX75mm普通流式管，15ml和50ml离心管z分选细胞收集管适配器：0.5ml离心管，1.5ml离心管，12mmX75mm普通流式管，6-1536孔板，玻片z可同时进行四路分选、6-1536孔板单细胞或任意制定细胞数分选、玻片任意矩阵分选z提供上样时温度控制装置和气溶胶防护装置适用范围z最佳检测和分选细胞大小范围：0.2—30umz细胞种类：真核细胞（组织分离细胞、细胞系、大病毒颗粒、细菌、酵母、血液、骨髓、体液细胞等）z可应用的荧光素标记物：FITC/GFP/CY3/YFP/PE/ECD/PI/PE-CY5/PerCP/TC/PE-CY7/APC/APC-CY7/HOECHST33342/DAPI/FLUO-2/FLUO-3/AlexaFluo系列及任何符合上述激发光及发射光检测滤片的荧光素z主要应用：„基于细胞表型的分析分选„基于细胞浆或细胞核（胞内）蛋白的分析分选„基于DNA倍体的细胞周期分析分选„基于代谢（如SidePopulation，SP）细胞的分选„常见实验方法：荧光蛋白转染、肿瘤干细胞和其它干细胞、细胞免疫功能、细胞周期、细胞凋亡、细胞信号传导、细胞器研究等。有标记物的几乎任何细胞的分析分选都可以进行。样本制备推荐方法z实验准备阶段：„目标细胞的MARKER,对应的抗体和荧光选择：了解需要检测的目标细胞的特异性标记和对应的抗体,选择商品化的抗体(荧光标记或未标记,合适的荧光素或二抗)„选择合适的荧光和抗体对照z样本处理„必须是单细胞悬液.外周血和骨髓收集时加抗凝剂即可进行染色,可溶解红细胞或直接进行检测和分选。.„培养细胞需要消化(推荐用混合蛋白酶消化,按照说明书浓度),过滤和洗涤至少一次后才能染色.组织样本必须通过研磨成单细胞并过滤后才能进行染色.„通常100-300目滤网(一次性,不锈钢或尼龙网都行).z荧光染色„按照106有效细胞与1ug抗体进行染色或按照抗体说明书推荐的量进行。如果商品化抗体指明实验次数,也要对标本的细胞浓度进行计数.染色通常室温30分钟或冰上1小时即可完成,染色体系体积通常在100-500ul,可以适量加入去处非特异性染色的BSA或其它血清。部分有特殊要求的抗体按照说明书进行染色.避光保存任何加有荧光的样本可以保护荧光素不被其它因素引起的淬灭。„稀释和过滤„在染色完成后通常加入PBS稀释样本至500-1000ul备检,在上机前最好再行过滤以防部分细胞(如肿瘤细胞)聚集成团.z细胞分选„如果样本细胞需要分选，保证样本处理和染色过程在无菌环境进行并尽量低温保证细胞活性，推荐细胞重悬在培养基/生理盐水/PBS„尽量浓缩分选的起始样本，推荐起始样本体积1ml;推荐样本中细胞浓度1X108/ml„收集分选细胞的试管或多孔板也要无菌，最好使用之前10%小牛血清封闭4度过夜，使用前弃去，加入1ml培养液待用„细胞分选所需的时间与样本细胞浓度有关，如果要快速分选，可以减少样本体积，10um以下的小细胞适合更高浓度„MoFloXDP可提供不同的分选要求组合逻辑来满足不同的实验需求Summit软件常用操作步骤1、开机，点击“Summit”图标，选择相应的数据库或新建数据库，点击OK，即打开操作软件；2、推荐预热30分钟后开始上样检测；3、运行光路和流路检查方案（例如Alignment），上标准微球（FLOW-CHECKFORFL1-FL5，FLOW-CHECKAPCFORFL6-FL7，SPECTRUMALIGNBEADSFORFL1-FL9），按照说明书进行稀释，以100EPS速度上样分析。检查每个荧光的单参数图的峰的CV值。如果大于488nm激光器的荧光第一和第二个通道CV值大于5%，运行系统清洁后再次检测，否则需要优化。4、建立Protocol：FileprotocolNew（新建）或者Load（使用已有的方案）。新建的protocol可以保存留待下次使用；z新建Protocol应包括：选择荧光通道及相应得获取参数(signal)，阈值（threshhold，可选择默认数值）,图形（histogram），每个通道的电压（Volts），补偿（Compensation），增益（Gain），门（Region），逻辑关系（Gate），统计参数（Statistics）等，实际应用中可以逐步来完成，但只有这些都有了这个方案才算完整。最重要的是电压（用对照来调，调好后设门确定阴阳性的分界线）和补偿（一定要在电压已经调节好的基础上再调，用单管单标记来调）。5、染色标本：同型对照管（未标记荧光或标记了同型对照的抗体），补偿管（分别单标记荧光），检测管（标记所有荧光）；z如果是新建一个测定的方案，一定要按照上述方法染色样本（单色标记可以不要补偿管）；z如果是用一个已经设定和保存好的方案，建议一批次用一个样本来设定上述各管来检查一下方案的准确性。6、调电压：上对照关调节每个通道电压或增益。FSC和SSC调节的目的是要看到样本中所有细胞和部分碎片，荧光通道上要看到正态分布的阴性峰（单参数图）或阴性群（双参数图）；z对于双参数图，对照管的细胞应该分布在X轴和Y轴的第一个对数标记101附近；设立十字门，让第三象限的细胞百分比〉98%，第一和第四象限的细胞百分比不为零；z对于单参数图，对照管的细胞应该正态峰可见，主要峰形分布在X轴的第一个对数标记101附近。设立阳性线形门，让门内的细胞的百分比2%；z电压和增益都是对细胞上散射光和荧光信号进行放大的方法。电压是线形放大，增益是倍数放大。当信号是HEIGHT/AREA时，电压和增益都可以调节；当信号是LOGHEIGHT时，只有电压可以调节，增益此时无效。z设门和逻辑关系方法：—双参数图门的设定，可以自由门，矩形门或椭圆形门—单参数图门的设定，只能设定线形门：设立“Bar”：在细胞峰右面选定阳性区域，单击右键，选“Region”，拖动“R”区域，使选定区域不为零，占总数的2%以下；7、补偿调节：针对两个以上荧光标记检测。电压保持不变，根据补偿管的图形，分别进行补偿“Compensation”或者“autocompensation”（自动补偿或手动补偿）z补偿正确的原则：—目视：横平竖直—读数：阴性细胞群和阳性细胞群的荧光中位数（Median）的差值小于0.58、样品测定：保持电压不变，补偿不变，上检测管检测，阅读结果，保存测定数据。每次测定完毕，进样针自动进行回流清洗。9、如果两周以上不开机，将鞘液桶内的鞘液换成蒸馏水，同时用蒸馏水上样跑5-10分钟后，可以防止鞘液结晶杜塞管道。10、请用格式化U盘一次性拷贝数据，或刻录数据光盘以免电脑染毒。Summit软件部分功能介绍一、图形叠加功能图形叠加功能包括在一个界面进行多文件（MultiFCSFiles）分析和对单参数直方图（Histogram）进行叠加（Overlay）1，先打开第一个FCS文件；2，增加一个NewTemplate3，选择NewTemplate需要的图形，如FSC/SSC等，系统自动将Database中下一个FCS文件载入：如何在图上显示统计参数4，补充完整分析这个文件的所需要的图形，并设立相应的逻辑关系（Gating）5，此时，在同一个界面就打开了2个FCS文件，可以分别进行分析。如果要进行FL1参数的叠加（OVERLAY），进行如下操作：在HISTOGRAMS的PANEL选择OVERLAY，在选择要叠加的参数：6，添加要叠加的图（ADDDATA）7，可以对OVERLAY的图形的线条、填充色和填充方式进行编辑8，通过COPY或另存图形文件将任意图形导出。二、如何直接在图片上对门（region）进行命名和显示统计结果1，打开需要分析的FCS文件2，点击要编辑的门（region），按右键，打开properties，在参数名称处改为需要命名的名字（如GFP）：点击确定，门即重新命名。3，在门（region）名称旁显示统计参数对参数选项进行编辑：从Histogram/plotStatistics一栏中选中需要在图形上显示的统计参数，点击“AttachtoRegion”，点击OK4，如果同时要在这张图上添加一个说明，鼠标在图上点击右键，选择Annotate在图形上就出现一个编辑区，即可输入任意说明（如TransferredwithPlasmidA）：分选的高级技巧1，分选收集管准备z如果样本细胞需要分选，保证样本处理和染色过程在无菌环境进行并尽量低温保证细胞活性z收集分选细胞的试管或多孔板也要无菌，使用之前10%小牛血清（稀释于PBS）加满整个试管于4度封闭过夜，使用前弃去，加入1-2ml培养液待用z收集结束后，立即离心样本管内细胞（300g，3-5分钟），弃上清，加入温（37度）培养液立即放置于适合的培养条件z目的：能减少收集管壁对