细胞培养技术

细胞培养技术北京大学医学部基础医学院细胞生物学系内容•第一节培养细胞学（Culturalcytology）•第二节体外培养（Invitroculture）•第三节培养细胞的分类•第四节培养细胞成功与失败综合分析•第五节细胞观察•第六节培养细胞学的常用术语培养细胞学（Culturalcytology）•细胞在体外培养的特定条件下，通过对离体细胞的研究，获取与三个学科相关信息：–细胞生理学–分子细胞学–细胞社会学•细胞生理学：–研究细胞生命活动规律•如何从环境中摄取营养•如何经过代谢获得能量•如何促进生长、分裂•如何诱导分化和表达功能•分子细胞学：–从遗传信息(DNA-RNA-蛋白质)角度研究胞内遗传物质的结构和表达的调控。•细胞社会学：–研究整体和细胞群中细胞间的社会行为，包括识别、通讯和相互作用；–研究整体和细胞群对细胞生长、分化和死亡等活动的调节控制。培养细胞学（Culturalcytology）•培养细胞学与细胞培养技术是生物医药领域的工具:–揭示生、老、病、死的规律–探索优生、抗衰老、防治疾病的手段或途径–人为地诱导细胞遗传性状的改变，以便有利于研究人类和自然界的关系。培养细胞学（Culturalcytology）•活细胞的研究是当前生命科学研究中的重要核心问题之一。–细胞生物学和分子生物学的相互渗透，分子克隆技术与细胞培养技术结合；–阐明基因的结构与功能–阐明基因在细胞生长和分化中的作用–阐明细胞癌变机制培养细胞学（Culturalcytology）•培养细胞学的应用–病毒学–细胞生物学–细胞工程学–干细胞生物学–淋巴细胞培养–遗传性疾病的产前检查–细胞毒性实验及生物实验的工具–在现代生物技术中应用•培养细胞学的应用–病毒学•培养细胞为病毒的增殖提供了场所；•细胞是分离病毒最好和最方便的基质；•体外培养的细胞存在以下特点：–无抗体，没有免疫力；–没有隐性感染；–接种量大；–不受非特异拮抗物质的影响，培养条件易于控制；–容易选择易感细胞，对病毒的敏感性比体内细胞高；–提高疫苗产量和质量；–加速病毒分离过程；–真核基因病毒载体的理想宿主•采用离心感染法或提取病毒核酸进行感染，细胞打孔器协助感染可扩大病毒感染的宿主范围；•培养细胞学的应用–病毒学•常用于病毒分离的细胞细胞种类可分离的病毒非洲绿猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒人单核细胞HIV、HTLV、HHV-6人胚肾、肺细胞腮腺炎病毒、腺病毒恒河猴猕猴肾细胞（二倍体细胞株）ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV人胚肺成纤维细胞株CMV、VZV、鼻病毒WI-38、MRC-5（传代细胞系）腮腺炎病毒、腺病毒Hela柯萨奇A、B组、RSVHep-2腺病毒、RSVVeroHSV、RSV、风疹病毒、轮状病毒、麻疹病毒•培养细胞学的应用–病毒学•病毒感染指标易观察，光镜下可见细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)、包涵体、细胞融合、血细胞吸附等现象，同时也便于用分子病毒学技术进行检测。•利用细胞培养进行病毒定性和定量，测定50％组织培养感染量(50％tissuecultureinfectiousdose，TCID50);•用于防治方面的研究：病毒的分离鉴定、抗原及减毒活疫苗制备和干扰素的生产，细胞是病毒增殖的场所。•细胞培养技术是伴随着病毒学的发展而发展起来的。•培养细胞学的应用–细胞生物学•单细胞克隆便于对细胞生物学的基础理论进行研究，如形态、结构、细胞器及其功能、遗传物质、核型、变异、细胞转化、生长周期等；•培养细胞学的应用–细胞生物学•离体培养细胞便于进行环境因素、药物等单因素及多因素影响的研究，探索作用机制。•细胞通讯和信号转导•细胞增殖与细胞周期的调控•细胞生长和分化、衰老和死亡•干细胞的应用研究•培养细胞学的应用–细胞工程学•细胞工程学是以培养细胞学为基础，以细胞培养技术为手段和工具。利用细胞融合及杂交技术，进行细胞工程的研究与开发。•如生物反应器的开发研究，将编码某生物活性物质的基因导入动物受精卵，从这种受精卵发育的动物组织、体液分泌物中获得外源基因的表达产物。•培养细胞学的应用–干细胞生物学•胚胎干细胞是机体最原始的细胞，具有较强的再生能力，在一定条件下可分化、增殖出各类细胞。•在体内干细胞数量极少，经增殖、分化参与构成各种组织和器官。•成体干细胞主要研究领域包括：–造血干细胞–神经干细胞–间充质干细胞inducedpluripotentstemcelliPS•培养细胞学的应用–淋巴细胞培养•在培养环境中，淋巴细胞受某些生长因子的刺激，出现旺盛的分裂、增殖。•用于研究机体免疫功能状况：–研究细胞标记–检测T、B细胞数量及功能–检测T细胞亚群(CD3、CD8、CD4等细胞)的变化•培养细胞学的应用–遗传性疾病的产前检查•羊膜穿刺术获得羊水中的胎儿细胞进行培养，在妊娠早期诊断胎儿是否患有先天性遗传病。•少量胎儿脱落细胞是能分裂的，经2-4周细胞培养，形成显著单层上皮样细胞，可按常规制备染色体。•产前检测出几十种代谢病与遗传病，较准确地指导优生优育。•培养细胞学的应用–细胞毒性实验及生物实验的工具•利用培养细胞进行毒性实验，对化学物质、放射线、激素、药物等提供了最简易而又可靠的方法。•采用肿瘤细胞进行抗癌药物的药敏测试，以指导临床抗癌药物的使用及配伍。•培养细胞学的应用–在现代生物技术中应用•基因分离、基因测序与表达、基因转移与重组、癌基因研究等。转基因猴“安迪”安迪于2000年10月2日出生于俄勒岗医学大学。2010年中国首例转基因猕猴近日在云南昆明培育成功。内容•第一节培养细胞学（Culturalcytology）•第二节体外培养（Invitroculture）•第三节培养细胞的分类•第四节培养细胞成功与失败综合分析•第五节细胞观察•第六节培养细胞学的常用术语体外培养（Invitroculture）一、培养分类：二、细胞的特性三、细胞生长与增殖四、培养细胞的增殖过程五、细胞和细胞、细胞和基质的相互关系六、细胞生存环境、条件和代谢体外培养（Invitroculture）一、培养分类：•细胞培养（cellculture）•组织培养（tissueculture）•器官培养（organculture）一、培养分类：•细胞培养（cellculture）–培养物是单个细胞或细胞群。»接种上皮细胞浓度：1～3x105/ml»接种成纤维细胞浓度：2～6x105/ml–细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长。–传代导致细胞出现单一化型。一、培养分类：•组织培养（tissueculture）–从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能的方法。»上皮组织：胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上皮组织。细胞形态较为规则，细胞间常以黏着物和特殊连接牢固相连。»身体不同部位的上皮组织，所处的位置有着不同的功能，主要表现为保护、吸收、排泄和分泌等功能。一、培养分类：•组织培养（tissueculture）–是在无菌的条件下将活器官、组织置于体外培养条件环境内，进行连续培养。–这种技术主要应用于农业、植物的研究。一、培养分类：•器官培养（organculture）–与组织培养条件相似，培养的是器官的原基–器官的一部分或整个器官–能够在体外生存、生长和保持一定功能体外培养（Invitroculture）一、培养分类：二、细胞的特性三、细胞生长与增殖四、培养细胞的增殖过程五、细胞和细胞、细胞和基质的相互关系六、细胞生存环境、条件和代谢二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•贴附型：细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependentcells)这种现象与细胞分化有关。–成纤维型细胞：(fibroblast)与体内成纤维细胞形态相似，胞体梭型或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状，漩涡或火焰状走行。–起源：细胞来自中胚层间充质组织，心肌、平滑肌、成骨细胞血管内皮细胞–注意：细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称，与体内成纤维细胞不同。二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•贴附型：–上皮型细胞(epithlialcells)：扁平不规则多角形、圆形核、细胞紧密相连成细胞增殖数目增多时,整个上皮膜随之移动。边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“拉网”现象与起源内外胚层组织有关。–起源：上皮细胞来自外胚层、中胚层和内胚层»外胚层来源上皮细胞：皮肤表皮（汗腺、皮脂腺)）、腺垂体、内耳迷路、角膜、晶状体、鼻腔、口腔、肛门»中胚层来源上皮细胞：间皮、内皮»内胚层来源上皮细胞：消化道分上皮、胸腺、肝、胰、肺泡上皮。二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•贴附型：–游走型细胞(wanderingcells)–特点：在支持物上散在生长，不连接成片，胞质伸出伪足，细胞在培养皿壁上生长不固定，变形或游走；–细胞易出现色暗的吞噬颗粒吞噬作用：单核巨噬细胞系统的细胞，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞及某些肿瘤细胞。二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•贴附型：–多形型细胞(polymorphiccells)–特点：无规律的形态，如神经细胞。二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•贴附型：•悬浮型细胞(suspendedcells)：不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。–S180肉瘤、K562、HL-60和白细胞。神经干细胞（neurosphereas）二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•分型的目的：–方便描述细胞在培养过程中的形态变化。–反映出细胞起源、正常异常的区别，作为判定细胞生物学性状指标。–一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响»反复开关培养箱»温度、CO2的浓度、培养基pH值变化»支原体污染等二、细胞的特性：根据是否附于支持物上生长的特性分为贴附型和悬浮型:•贴附现象是复杂和受多种因素的影响。–细胞不贴附：底物表面不干净;–利于细胞贴附的底物表面带有阳性物质与特殊物质»纤粘连蛋白(fibronectinFN)»细胞表面蛋白(cellsurfaceproteinCSP)–细胞表面的粘附分子–血清体外培养（Invitroculture）一、培养分类：二、细胞的特性三、细胞生长与增殖四、培养细胞的增殖过程五、细胞和细胞、细胞和基质的相互关系六、细胞生存环境、条件和代谢三、细胞生长与增殖：•培养细胞的生存环境局限于培养瓶、皿或其他容器，生存空间及营养有限，当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为“传代”(passage或subculture)。•注意：每次传代细胞在生长和增殖方面均受到一定的影响。三、细胞生长与增殖：•细胞生命期(lifespanofculturalcells)–指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。–二倍体的成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下可传40～60代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生命，细胞便开始凋亡(apoptosis)。LeonardHayflickYoungfibroblastOldfibroblast细胞在生存过程中经历以下三个阶段三、细胞生长与增殖：•细胞生命期–原代培养期(primaryculture)组织到第一次传代时间大约为1～4周特点：细胞活跃移动，分裂，增殖不旺盛，多呈二倍体核型。原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。–各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养，细胞克隆的形成率(cloningeff