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啤酒发酵工艺研究钱龙（常州工程职业技术学院制药系，江苏常州213164）摘要：根据实验室啤酒发酵过程及方法，介绍其发酵流程及啤酒酵母的培育情况，应用摇瓶法发酵啤酒，测定发酵产物中的酒精度，并用糖锤度计测定麦芽汁糖度，熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。[1]关键词：啤酒发酵，菌种培育，啤酒酵母，发酵罐，扩大培养中图分类号：Q815献标识码：ABeerFermentationProcessLanJinna(Hengshui,HebeiInstituteofLifeSciencesDepartmentofBiotechnologyProfessional,HebeiHengshui053000)Abstract:Accordingtothelaboratoryofthebeerfermentationprocessandmethodtointroducethecultivationofthefermentationprocessandbrewer'syeast,theshakeflaskmethodfermentationbeermeasuredtheAlcoholfermentationproducts,anddeterminationofwortsugarcontentandsugarhammermeterfamiliarstaticcultureoperation,observethebeerfermentationprocess,analysisofoperationalskillsmasteredthefermentationprocessindicators.[2,3]Keywords:beerfermentation,bacteriacultivation,brewer'syeast,fermentationtanks,expandingculture引言啤酒发酵过程是指啤酒酵母在一定条件下，原料为大麦﹑酿造用水﹑酒花﹑酵母以及淀粉质辅助原料(大米﹑大麦﹑小麦等)和糖类辅助原料等，利用麦汁中的可发酵性物质而进行的正常生命活动的产物。[4]啤酒主发酵是静止培养的典型代表，是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，在一定温度下培养的过程。酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。啤酒是一个成分非常复杂的胶体溶液。啤酒的感官性品质同其组成有密切的关系。由于酵母菌类型的不同，发酵的条件和产品要求、风味等的不同，造成发酵方式也不相同。根据酵母发酵类型不同可把啤酒分成上面发酵啤酒和下面发酵啤酒。一般可以把啤酒发酵技术分为传统发酵技术和现代发酵技术。[5]本研究的啤酒发酵过程分为：（1）麦汁制备（2）酵母酵母计数与质量鉴定（3）菌种扩大培养（4）啤酒主发酵和后发酵（5）各项指标测定。1.材料与方法1.1实验材料1.1.1菌株：酿酒酵母1.1.2实验器材：实验室糖化器；白色滴板或瓷板；玻棒；温度计；滤纸；漏斗；电炉；糖化锅；显微镜；血球计数板；恒温水浴锅；恒温培养箱；生化培养箱温箱；高压蒸汽灭菌锅；带刻度的锥形离心管；带冷却装置的发酵罐（50L，100L）；分光光度计1.1.3试剂：碘溶液，0.02N；pH4.5的醋酸缓冲液；0.025%美兰；0.1N碘标准溶液；碘酸钾稀释液；斐林溶液；1％美蓝指示剂1.2实验方法1.2.1协定法糖化麦汁的制备1.2.1.1麦汁制备取50g麦芽，用植物粉碎机将其粉碎；在已知重量的糖化杯（500~600mL烧杯或专用金属杯）中，放入50g麦芽粉，加200mL46~47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温30分钟；使醪液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴，在25分钟内升至70℃。此时于杯内加入100mL70℃的水；70℃保温1小时后，在10~15分钟内急速冷却到室温；冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g；用玻棒搅动糖化醪，并注于干漏斗中进行过滤，漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸，滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿；收集约100mL滤液后，将滤液返回重滤。过30分钟后，为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中；浸出糖化。35~37℃，保温30分钟--→50~52℃60分钟--→65℃30分钟（至碘液反应基本完全）--→76~78℃送入过滤槽；麦汁过滤：将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开，得到澄清麦汁的过程；麦汁煮沸过滤：将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程。此过程中可加入酒花（一种含苦味和香味的蛇麻之花，每100升麦汁中添加约200克）。将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾，煮沸时间一般控制在1.5~2小时，蒸发量达15~20%。1.2.1.2糖化时间的测定在协定法糖化过程中，糖化醪温度达70℃时记录时间，5分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁1滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液1滴，混合，观察颜色变化。每隔5分钟重复上述操作，直至碘液呈黄色（不变色）为止，记录此时间。[6,7]由糖化醪温度达到70℃开始至糖化完全无淀粉反应时止，所需时间为糖化时间。1.2.1.3过滤速度的测定以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算，以快、正常和慢等来表示，1小时内完成过滤的规定为“正常”，过滤时间超过1小时的报告为“慢”。1.2.1.4气味的检查糖化过程中注意糖化醪的气味。具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味，应报以“正常”；若样品缺乏此味，则以“不正常”表示，其它异味亦应注明。1.2.1.5透明度的检查麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。1.2.1.6蛋白质凝固情况检查强烈煮沸麦芽汁5分钟，观察蛋白质凝固情况。在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀，记录为“好”；若蛋白质凝结细粒状，但麦汁仍透明清亮，则记录为“细小”；若虽有沉淀形成，但麦芽汁不清，可表示为“不完全”；若没有蛋白质凝固，则记录为“无”。1.2.2酵母酵母计数与质量鉴定取清洁的血球计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖专用盖玻片，取酵母菌液一小滴，滴至盖玻片的边缘，让菌液渗入计数室内，静置5分钟，将计数板置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到计数板的方格网，并移至视野中间，找到计数室位置（中间一个大方格），并看清由双线包围的中方格（16或25格）及由单线包围的小方格（共400格），计数大格内的酵母细胞总数。酵母细胞用0.025%美兰水溶液染色后，由于活细胞具有脱氢酶活力，可将兰色的美兰还原成无色的美白，因此染不上颜色，而死细胞则被染上兰色。计数死亡细胞数和出芽细胞数。计数的同时首先观察酵母的形态。1.2.3酵母的扩大培养1.2.3.1培养基的配制取协定法制备的麦芽汁滤液加水定容至糖度为10BX，取50mL装入250mL三角瓶中，每个小组三瓶，包上瓶口布后，0.05Mpa灭菌30分钟。1.2.3.2菌种扩大培养取麦汁斜面菌接种到麦汁平板上，在28℃条件下培养两天。镜检后挑去单菌落3个接种到50ml麦芽汁三角瓶中。在20℃条件下培养两天，每天摇动三次。接种到550ml麦汁三角瓶中，在15℃条件下培养三天，每天摇动三次。注意无菌操作。1.2.4啤酒主发酵和后发酵在1000mL三角瓶中进行啤酒主发酵小型试验。具体方法如下：将麦汁加水，使糖度达到10Bx，0.05Mpa灭菌30分钟。冷却后摇动充氧，沉淀。将50mL酵母菌种接入，在10℃生化培养箱中发酵，每天观察发酵情况。主发酵：10℃，7天→至4.0plato时结束（嫩啤酒）。一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期，起泡期、高泡期、落泡期和泡盖形成期等五个时期。仔细观察各时期的区别。后发酵在0~2℃下利用酵母菌本身的特性去除嫩啤酒的异味，使啤酒成熟。当发酵罐中的糖度下降至4.0~4.5BX时，开始封罐，并将发酵温度降至2℃左右，8~12天后，罐压升至0.1Mpa，说明已有较多CO2产生并溶入酒中，即可饮用。1.2.5各项指标测定1.2.5.1麦芽汁糖度测定取100mL麦汁或除气啤酒，放于100mL量筒中，放入糖锤度计，待稳定后，从糖锤度计与麦汁液面的交界处读出糖度，同时测定麦汁温度，根据校准值，计算20℃时的麦汁糖度。若糖度较低，糖度计不能浮起来，可多加一些麦汁，直至糖度计浮在液体中。1.2.5.2酒精度测定在已精确称重至0.05g的500mL三角烧瓶中，称取l00.0g除气啤酒，再加50mL水，按上冷凝器，冷凝器下端用一已知重量的100mL容量瓶或量筒接收馏出液。若室温较高，为了防止酒精蒸发，可将容量瓶浸于冷水或冰水中。开始蒸馏时用文火加热，沸腾后可加强火力，蒸馏至馏出液接近100mL时停止加热。取下容量瓶，于普通天平上加蒸馏水至馏出液重100.0g，混匀。用比重瓶精确测定溜出液比重。查比重和酒精对照表，求得酒精含量。1.2.5.3α–氨基氮含量的测定适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL（麦汁一般稀释100倍，啤酒50倍，啤酒应先除气）。取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液，另3支各吸入2mL试样稀释液，剩下3支吸入2mL蒸馏水。然后各加显色剂1mL，盖玻塞，摇匀，在沸水浴中加热l6分钟。取出，在20℃冷水中冷却20分钟，分别加5mL碘酸钾稀释液，摇匀。在30分钟内，以水样管为空白，在570nm波长下测各管的光密度。1.2.5.4色度的测定取2支比色管，一支中加入100mL蒸馏水，另一支中加入100mL除气啤酒发酵液（或麦芽汁，或啤酒），面向光亮处，立于白瓷板上。用1mL移液管吸取1.00mL碘液，逐滴滴入装水比色管中，并不断用玻棒搅拌均匀，直至从轴线方向观察其颜色与样品比色管相同为止，记下所消耗的碘液毫升数（准确至小数后第二位）V。样品的色度=10NV。2．结果与分析2.1协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会（EBC）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。表1协定法糖化试验结果糖化时间过滤速度气味透明度蛋白质凝集情况25min正常正常微雾好2.2在发酵过程中，为了跟踪发酵的进程，判断发酵是否正常，也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。表2酵母细胞计数酵母细胞数死亡细胞数出芽细胞数2175272161355431859死亡率：4.2/15*100%=28%出芽率：5.2/15*100%=34.7%酵母形态：优良健壮的酵母菌，应形态整齐均匀，表面平滑，细胞质透明均一。年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质；老熟的细胞出现液泡，呈灰色，折光性较强；衰老的细胞中液泡多，颗粒性贮藏物多，折光性强。2.3各项指标测定结果表3各项指标测定结果糖度酒精度色度122.30%1酒精度的测定：A=82.2083g,B=82.1884g,C=31.4706g,d2020=(B-C)/(A-C)=0.9996,经查表的酒精度为0.230。色度的测定：附表：EBC法与Brand法色度单位的比较（部分）EBCBrandEBCBrandEBCBrandEBCBrandEBCBrand2.00.112.50.143.00.173.50.214.00.234.50.275.00.305.20.315.40.325.60.345.80.356.00.366.20.376.40.396.60.406.80.417.00.437.20.447.40.457.60.477.80.488.00.498.20.518.40.528.60.539.00.569.20.589.40.599.60.60100.62120.78140.93161.1181.3201.43.讨论3.1发酵泡沫抑制剂的作用原理及对发酵结果影响的分析添加发酵泡沫抑制剂的作用原理是泡沫抑制剂以微粒的形式，渗入到发酵液泡沫的两气泡之间的液膜中去，并捕获泡沫表面的疏水链端，形成很薄的双分子膜层，再经扩散，层状侵入，从而进一步扩散到气泡泡膜中。[8,9]由于发酵泡沫抑制剂(聚二甲基硅氧烷)的表面张力很低，使泡膜的表面张力局部下降，膜壁逐步变薄，被表面张