胃癌循环肿瘤细胞的检测和临床意义

中华胃肠外科杂志２０１6年9月第１9卷第9期ＣｈｉｎＪＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔＳｕｒｇ，September２０１6，Ｖｏｌ．１9，Ｎｏ．9ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１鄄０２７４．２０１6．09．０29作者单位：030001太原，山西医科大学附属肿瘤医院病因室通信作者：荆结线，Email：[e-mail]【摘要】胃癌患者的死亡主要源于肿瘤的复发与转移，而循环肿瘤细胞（ＣＴＣ）是转移的必要条件，作为液体活检具有一定的临床意义。胃癌ＣＴＣ数量较少，检测需要经过富集，方法包括密度梯度离心法等基于ＣＴＣ的密度、大小及介电差异等物理特性的方法，以ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍ为主的基于免疫源性的方法，以及基于微流控芯片技术的方法。胃癌ＣＴＣ的检测鉴定多采用免疫荧光法，对分离出来的ＣＴＣ还可进行核酸水平、蛋白水平及调控水平的后续分析。胃癌ＣＴＣ的检测有助于临床上判断预后、评估分期、监测疗效及指导药物的研发。尽管胃癌ＣＴＣ的临床转化也面临富集效率低、特异性表面标记少、以及辅助诊断效率未明等诸多挑战，但相对于病理活检，ＣＴＣ取材无创，可反复取材、实时监测病情及指导临床治疗，具有良好的研究前景。本文就胃癌ＣＴＣ的检测鉴定及其临床价值进行介绍。【关键词】胃肿瘤；肿瘤细胞，循环；液体活检；转化型研究DetectionandclinicalsignificanceofcirculatingtumorcellsingastriccancerＹａｏＹｕｅｊｕａｎ，ＪｉｎｇＪｉｅｘｉａｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｔｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙAｆｆｉｌｉａｔｅｄＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔａｉｙｕａｎ０３００0１，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＪｉｎｇＪｉｅｘｉａｎ，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｔｈｅｄｅａｔｈｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｉｓｍａｉｎｌｙｄｕｅｔｏｉｔｓｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ（ＣＴＣ）ｉｓｔｈｅｎｅｃｅｓｓａｒｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ａｓｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ，ＣＴＣｄｅｔｅｃｔｉｏｎｈａｓｉｔｓｃｅｒｔａｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｂｅｃａｕｓｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｒｅｒａｒｅ．Ｍａｎｙｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄ：ｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｐｈｙｓｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＴＣＴ，ｌｉｋｅｄｅｎｓｉｔｙ，ｓｉｚｅａｎｄｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｏｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｌｉｋｅＣｅｌｌＳｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍ；ａｎｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＴｈｅｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＣＴＣｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒａｎｄｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄＣＴＣｃａｎａｌｓｏｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣＴＣｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｉｓｈｅｌｐｆｕｌｔｏｊｕｄｇｅｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，ａｓｓｅｓｓｓｔａｇｉｎｇ，ｍｏｎｉｔｏｒｔｈｅｃｕｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔａｎｄｇｕｉｄｅｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｒｕｇ．ＴｈｅｒｅａｒｅｍａｎｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＣＴＣ：ｔｈｅｌｏｗｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｔｈｅｌｅｓｓｓｐｅｃｉｆｉｃｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓ，ｔｈｅｕｎｃｅｒｔａｉｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｓｏｏｎ，ｂｕｔｉｔａｌｓｏｈａｓｔｈｅｇｏｏｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｓｐｅｃｔｂｅｃａｕｓｅｉｔｉｓｎｏｎ鄄ｉｎｖａｓｉｖｅ，ｒｅｐｅａｔａｂｌｅａｎｄｃａｎｒｅａｌ鄄ｔｉｍｅｍｏｎｉｔｏｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｎｄｇｕｉｄｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｂｉｏｐｓｙ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆＣＴＣｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．【Ｋｅｙwｏｒｄｓ】Ｓｔｏｍａｃｈｎｅｏｐｌａｓｍｓ；Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ；Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ；Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈ胃癌的致死原因主要源于肿瘤的复发与转移［１鄄２］。转移发生的必要条件是肿瘤细胞进入血循环，因此早期发现血液中的肿瘤细胞（即循环肿瘤细胞，ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ，ＣＴＣ）能为临床及时干预提供基础。相对于病理活检，ＣＴＣ取材无创，可反复取材、实时监测病情并指导临床治疗，有可能改善肿瘤患者的生存。然而，目前胃癌ＣＴＣ相关研究进展缓慢。因为相对于其他肿瘤，胃癌多通过淋巴转移，血行转移出现较晚；且由于胃的血液要先通过肝脏处理，胃癌患者外周血ＣＴＣ数量较少，检测困难。但根据现有研究仍可发现，ＣＴＣ在胃癌的诊疗中有一定的临床意义，在作为标本进行胃癌的靶点检测方面具有潜力［３］。因此，本文就胃癌ＣＴＣ的检测鉴定及其临床价值做一综述，以期为胃癌ＣＴＣ的研究作参考。一、ＣＴＣ的检测方法由于血液中ＣＴＣ的数目较少，不能直接用于检测，必须首先对其进行富集分离，因此ＣＴＣ的检测分为富集分离及鉴定分析两部分。（一）ＣＴＣ的富集分离方法１．基于物理特性：早期的分离方法多基于ＣＴＣ的密度、大小及介电差异等物理特性。Ｇｅｒｔｌｅｒ等［４］采用密度梯度离心法对ＣＴＣ进行富集，回收率在７０％～９０％之间，但强大的离心力对细胞损伤较大。Ｓｏｌｌｉｅｒ等［５］用基于细胞大小原理的涡流技术对ＣＴＣ进行富集，纯净度为５７％～９４％。Ｚｈｅｎｇ等［６］采用模型微滤器设备对ＣＴＣ进行捕捉，回收率高达９０％，其认为这种基于细胞大小原理的方法基本不破坏细胞，能更好的进行后续分析，但因细胞大小异质性大，所获得的细胞特异性较差。Ｙａｎｇ等［７］利用细胞介电性质差异，采用双向电泳技术富集ＣＴＣ，回收率及纯净度达９５％以上，但该方法·综述·胃癌循环肿瘤细胞的检测和临床意义姚月娟荆结线1077CMYK中华胃肠外科杂志２０１6年9月第１9卷第9期ＣｈｉｎＪＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔＳｕｒｇ，September２０１6，Ｖｏｌ．１9，Ｎｏ．9通量过低。Ｇａｓｃｏｙｎｅ等［８］对双向电泳技术进行改进，每次可处理多达４．５ｍｌ的血液，但细胞回收率仅１０％；类似报道也见于Ｈｕａｎｇ等［９］的研究中，只有降低通量，回收率才能再度上升，故限制了该方法的应用。尽管物理富集方法多样，但各研究的纯净度参差不齐，且单纯依靠细胞的物理特性对细胞进行分离说服力差，目前研究更倾向于依靠细胞免疫源性差异进行富集的方法。２．基于免疫源性：利用磁珠包被抗体来富集上皮细胞粘附分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＥｐＣＡＭ）表达阳性的癌细胞的ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍ（美国强生公司）因９９．７％的特异性被美国食品和药品管理局（ｆｏｏｄａｎｄｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）于２００４年批准上市，目前是ＣＴＣ富集的“金标准”。但磁珠富集及洗脱过程均会对细胞造成破坏，影响后续检测；且随着肿瘤的演进，肿瘤细胞发生上皮间质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ），表现为上皮源性标记物（如ＥｐＣＡＭ）表达减少、间质源性标记物（如Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）表达增加，导致不表达或低表达ＥｐＣＡＭ的ＣＴＣ漏检。为应对以上问题，Ｌｉ等［３］运用差向富集技术联合免疫荧光原位杂交对晚期胃癌患者循环肿瘤细胞进行阴性富集，该方法不依赖ＥｐＣＡＭ的表达，阳性率达９０．５％，且具有可后续分析癌细胞的优点。但Ｈｙｕｎ等［１０］运用阴性富集法富集胃癌ＣＴＣ时发现，所有病例均出现ＣＴＣ的漏检，这是由于细胞角蛋白（ｃｅｌｌｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）阳性、ＣＤ４５＋双阳性ＣＴＣ的存在，导致抗ＣＤ４５单抗不仅筛选了白细胞，还筛去了部分ＣＴＣ细胞，降低了阴性富集法的灵敏度。这种双阳性ＣＴＣ的机制有待进一步阐明。Ｇａｌｌｅｔｔｉ等［１１］用抗ＨＥＲ鄄２抗体对胃癌ＣＴＣ进行捕捉，显示出良好的特异性，但对ＨＥＲ鄄２阴性的ＣＴＣ仍然无捕捉能力。联合检测或能改善这一缺憾，Ｙｕ等［１２］采用抗ＥｐＣＡＭ／人类表皮生长因子受体2（ＨＥＲ鄄２）／表皮生长因子受体ＥＧＦＲ抗体对ＣＴＣ进行联合捕捉，捕捉效率稳定于８０％~９０％，为ＣＴＣ的富集提供了新思路。３．基于微流控芯片技术：微流控技术是一种基于ＣＴＣ物理及免疫特性在微米尺度的流道内对滋ｌ或ｐｌ量级的液体进行控制的技术，该方法具有分离速度快、样本消耗低、高通量及低成本等优点。Ｌｉｎ等［１３］将第3代纳米芯片与热敏系统结合，通过温度改变，对所捕捉的ＣＴＣ进行释放，释放所得ＣＴＣ的存活率达９０％左右，对ＣＴＣ的后续研究，如体外培养、药物试验有着很好的应用前景。但因各研究采用的芯片种类繁多，无统一标准，缺乏大型临床数据，微流控芯片技术离大规模应用于临床尚有距离。（二）ＣＴＣ的鉴定分析方法１．ＣＴＣ的鉴定：因富集方法不同，鉴定方法亦差异很大，但多采用免疫荧光法，如前所述的应用免疫源阳性富集法的ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍ，即采用ＣＫ荧光抗体识别并通过４，６二脒基苯基吲哚（４，６鄄ｄｉａｍｉｄｉｎｏ鄄２鄄ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，ＤＡＰＩ）荧光核染阳性，ＣＤ４５抗体排除血液中的白细胞，从而找到ＣＫ＋、ＤＡＰＩ＋、ＣＤ４５-并且符合肿瘤形态学特征的细胞，将其定义为ＣＴＣ。然而，由于ＥＭＴ导致部分ＣＴＣ丧失了ＣＫ的表达，以及ＣＫ＋、ＣＤ４５＋双阳性ＣＴＣ的存在等原因，造成了部分ＣＴＣ可能被漏检。而Ｌｉ等［３］阴性富集法将ＤＡＰＩ＋、ＣＫ＋／-、ＣＤ４５-且荧光原位杂交染色体呈现多倍体的细胞定义为ＣＴＣ，改善了由于ＥＭＴ导致的漏检问题，但仍未解决双阳性ＣＴＣ、染色体呈现二倍体的肿瘤细胞等影响灵敏度的问题。Ｉｔｏ等［１４］将具有端粒酶特异性并携带绿色荧光蛋白的腺病毒对外周血细胞进行转染，通过计数绿色荧光蛋白来鉴定ＣＴＣ。然而该方法尽管消除了ＥＭＴ的影响，却受病毒转染能力等外来因素干扰较大。由于ＣＴＣ的异质性及演进，目前各种鉴定方法都有其局限性，尚需进一步优化，以期更大限度的提高灵敏度及特异性。２．ＣＴＣ的后续分析：对分离出来的ＣＴＣ还可采用目前较为成熟的技术对其进行核酸水平、蛋白水平及调控水平的后续定性分析，可更加深入的了解转移的机制，进一步指导临床治疗，也是目前临床研究的热点。Ｙｕａｎ等［１５］对胃癌ＣＴＣ进行ｍｉＲＮＡ检测，发现ＣＴＣ内ｍｉＲ鄄２００高表达，并证实ｍｉＲ鄄２００参与了ＥＭＴ过程，促进了转移的发生。二、ＣＴＣ检测的临床意义１．判断预后：现有研究为ＣＴＣ判断预后的临床价值提供了循证医学证据。Ｕｅｎｏｓｏｎｏ等［１６］发现ＣＴＣ≥１个／７．５ｍｌ的阳性胃癌患者无复发生存及总生存明显低于ＣＴＣ阴性的患者，是胃癌的独立预后因素。Ｈｉｒａｉｗａ等［１７］发现ＣＴＣ≥２个／７．５ｍｌ的阳性Ⅳ期胃癌患者的生存期显著短于阴性患者。Ｌｅｅ等［１８］也发现ＣＴＣ≥５个／７．５ｍｌ阳性晚期胃癌患者的中位ＰＦＳ及ＯＳ明显短于阴性患者（分别为５９ｄ比１４１ｄ，１２０ｄ比２２０ｄ）。由于胃癌ＣＴＣ的富集困难，目前相关研究仍无统一的临界值。但尽管临界值不同，Ｚｈａｎｇ等［１９