一、网织红细胞(Ret)计数

网织红细胞（Ret）计数RBC生成过程：多能干细胞原红早幼红中幼红晚幼红成熟RBCRet概念:是介于晚幼红和成熟红细胞之间尚没有完全成熟的红细胞，因其胞浆中尚有残存的嗜碱性物质（RNA、核糖体）经活体染色后，聚集成深染颗粒，颗粒多时形成网状，故名网织红细胞。正常情况下，晚幼红脱核后平均需2天才能发育成完全成熟的RBC。RETRET分型较成熟RBC稍大，直径8.0～9.5µm。0ⅠⅡⅢⅣ骨髓，外周难见周围血少量外周最多(0.08%)(0.15%)（60%以上）花冠型丝球型网型、破网型点粒型有核充满，相互连接松散，连成网稀疏，丝点状散在，细颗粒细丝状ICSH及NCCLS的定义：网织红细胞是已不含有细胞核的红细胞，故认为应分四型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。RET【器材和试剂】1.显微镜、Miller窥盘。2.新亚甲蓝染液（WHO推荐）新亚甲蓝N0.5g草酸钾1.6g蒸馏水100ml，用前过滤。WHO推荐，其对Ret染色力强且稳定，但该染液在室温下只稳定3周；3.灿烂甲酚蓝染液：灿烂甲酚蓝1g柠檬酸三钠0.4g氯化钠0.85双蒸水100ml，用前过滤。费用低廉，国内目前使用的主要方法；但易产生沉淀。AB13四、操作1.取小试管一支，加染液和血液各2滴，混匀。2.置37℃水浴箱15min，取出后微振2min，推片。3.将Miller窥盘放入目镜，选择合适部位计数，油镜下Miller窥盘的小格A内计数所有无核红细胞，大格B（含小格面积）内计数网织红细胞。或计数1000个红细胞中的网织红细胞数。五、计算1.Ret%=×1002.绝对值计算:RBC×Ret%（×109/L）大格网织红细胞总数小格红细胞总数×9AB13控制Ret计数CV=10%(ICSH推荐)需镜检的RBC数Ret（%）窥盘小方格内镜检RBC数相当镜检RBC总数１～２10009000３～５5004500６～10200180011～25100900【正常参考值】方法年龄组相对值（%）显微镜成人、儿童0.5～1.5计数新生儿2.0～6.0【测定方法及评价】1.显微镜计数法：国内的主要方法，器材价廉、作简单、费用低。缺点：工作效率低、精密度低，操作批内重复CV在20%以上；其相对计数结果（%）显著受成熟RBC浓度的影响，使用Miller窥盘可将计数精密度控制在CV≤15%，可提高工作效率。2.网织红细胞仪测定法：采用流氏细胞技术，将RBC经特殊荧光染料染色后，使含有RNA的RBC被计数，自动计算出RET的%及绝对数。优点：测量细胞多，避免主观因素、方法易于标准化。国外已广泛使用，国内逐步推广使用。但成本高。近年来，新型多参数血细胞分析仪具有Ret计数功能。【质量控制】1.抗凝血最好在4h内处理，保存在4ºC，可延长至8h.2.染色温度控制在37ºC为宜，无论何种染液，室温（25ºC）以下染色时，RET检出率明显减低，故要求37ºC恒温染色。3.玻片法容易使血液中的水分蒸发，造成涂片困难，受染料沉淀的干扰，故已少用。4.试管法为手工RET计数的首选方法，染液与血液的比例以1:1为宜，严重贫血时可适当增加血液比例。5.推制血膜不宜太薄或太厚，否则会造成RET分布不均。6.ICSH推荐使用Miller窥盘作Ret计数，其CV=10%±【临床意义】（1）评价骨髓造血功能：①RET↑是红系造血功能活跃的反映。表示骨髓造血功能旺盛，见于增生性贫血，以溶贫最为显著（6～8%，急性溶血可达20%，严重者可达40～50%）；急性失血可明显↑；缺铁和巨贫RET正常或轻度↑。②RET↓表示骨髓造血功能减低，多见于再障，尤以急性再障最为显著，典型病例RET常低于0.5%，甚至为0，RET绝对值低于15×109/L常作为再障的诊断标准之一。也可见于急性白血病时骨髓红系增生受抑制或因化疗、放疗造成的骨髓抑制。【临床意义】（2）贫血治疗的疗效观察：①巨贫、缺铁经合理治疗后，RET逐渐↑，并先于RBC、Hb的↑。用药后3～5d开始↑，7～10d达高峰(一般为6～8%，高者达10%)，治疗2周左右逐渐下降，然后RBC、Hb才逐渐↑。②再障治疗有效时，RET逐渐回升甚至轻微升高。【临床意义】（3）作为观察病情的指标：①溶血和失血性贫血在治疗过程中，连续进行RET计数，可作为判断病情变化的参考指标。如治疗后RET逐渐降低，表示溶血或出血已得到控制；如RET持续不减低，甚至更见增高，表示病情未能控制，甚至还在加重。②RET计数对骨髓移植后造血功能重建情况及造血功能状态估计有一定价值。如Ret15×109/L,表示无移植并发症；若Ret15×109/L，说明可能失败。血红蛋白测定血红蛋白组成珠蛋白肽链（4条）,每条折叠的珠蛋白肽链结合1个亚铁血红素，分子量64458（不带O2）。血红蛋白珠蛋白肽链亚铁血红素珠蛋白肽链亚铁血红素珠蛋白肽链亚铁血红素珠蛋白肽链亚铁血红素原卟啉Fe2+原卟啉Fe2+原卟啉Fe2+原卟啉Fe2+血红蛋白特点1.完整的Hb分子，具有四级空间结构的四聚体，只有这种四级结构才具备结合O2和CO2的能力。2.珠蛋白具有种属特异性,每个珠蛋白分子含两条α链和非α链。正常成人Hb有三种:①HbA(α2β2),占90%,②HbA2(α2δ2)，占2～3%，③HbF(α2γ2，＜2%）；新生儿HbF占70%，1岁后降至成人水平。血红蛋白结构图血红蛋白特点3.亚铁血红素无种族特异性，由2价铁离子和原卟啉组成呈扁平型。4.Hb状态氧合Hb(HbO2）--与O2结合，还原Hb(Hbred）-脱氧碳氧Hb（HbCO）-与CO结合，高铁Hb(Hi)-被氧化成。硫化Hb（SHb）-病理情况Hb及衍生物因结构不同具有不同的吸收光谱。5.Hb功能运输O2和CO2,结合可逆。1分子Hb结合1分子O2，在标准状况下，每克Hb能结合1.39mlO2。。血红蛋白测定•测定血液中各种血红蛋白的总浓度。•方法有多种血红蛋白计法氰化高铁血红蛋白法（HiCN）十二烷基硫酸钠血红蛋白测定法（SLS-Hb）其他方法血红蛋白计法步骤1加盐酸比色方管内加入1.10当量盐酸到刻度20%（蓝色）2采血采血20μl,擦去管外余血加入，清洗2-3次，混匀,使血液与盐酸混合，成均匀黄褐色，将方管插入比色架，无刻度面放前后面。3稀释10分钟后滴加蒸馏水稀释，同时不断搅动混合，边滴边观察色泽是否与标准黄褐色相同。接近时，慢慢加入直到颜色完全相同，停止滴加蒸馏水。4读数此时观察方管内凹最低处刻度即每100ml血液中含血红蛋白克数（红色）。一、氰化高铁血红蛋白法【原理】除SHb外，其他Hb均可被高铁氰化钾氧化成高铁Hb(Hi)，再与试剂中的CN-结合，生成稳定棕红色的HiCN，在540nm处比色，求得Hb的克数。【器材和试剂】1.分光光度计或血红蛋白比色计2.血红蛋白转化液：WHO和国家卫生部临床检验中心推荐(文-齐氏液)高铁氰化钾K3[Fe(CN)3](AR)200mg氰化钾KCN50mg磷酸二氢钾KH2PO4140mgTritonX-1000.5～1.0ml加水至1000ml。【操作】20µl血加入5ml转化液,冲洗吸管2～3次混匀,室温置５min后，转化液作空白，于540nm（1cm光径）比色。【计算】Hb(g/L)=Aλ540×64458/(44×1000)×251=A×367.7也可用市售Hb标准品（50、100、150、200g/L）作标准曲线。也可用校准后得血红蛋白仪直接测定。【注意事项】本试剂中含有少量KCN，废液必须无害化处理。废液处理：用水按1:1稀释,再按每升液体加35ml次氯酸钠，充分混匀，敞开容器口，过夜，使CN-氧化成N2和CO2↑，或水解成CO32-和NH4+，然后倒入下水道。氰化高铁血红蛋白法【方法学评价】1.氰化高铁血红蛋白（HiCN）法：特点：①WHO和ICSH推荐的标准方法，540②具有操作简单、③结果稳定可靠，504④参考品保存时间长，便于质控，⑤读取光密度后可直接定值等优点。缺点：①不能测SHb；②对HbCO转化速度慢（需100min）；③高球蛋白或高白细胞血样，试剂易浑浊；④含剧毒药品KCN.应作减毒处理。两种方法比较HiCN法比色法定体积定吸光度测吸光度计算测体积计算精度高精度低仪器试剂要求高仪器试剂要求低【方法学评价】3.十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-Hb）测定法：原理：除SHb外，其他Hb均可与低浓度SDS生成SDS-Hb棕红色化合物。最大吸收峰538nm,波谷500nm,其摩尔消光系数不确定，不能用吸光度值直接计算。特点：试剂无毒、结果准确、重复性好，缺点：其依赖HiCN法间接得出结果，该试剂可破坏WBC，不适于血细胞分析仪4.叠氮高铁血红蛋白（HiN3）测定法：试剂毒性较低，较准确、重复性较好，但仍存在公害问题，对HbCO转化慢（20min）。5.碱羟血红蛋白（AHD575）测定法：优点：准确度、精密度均较高，参比标准为氯化血红素。缺点：参比标准纯度不达标，不便自动分析。【方法学评价】6.血细胞分析仪法逐渐替代手工，优点：操作简单、快速，同时可获得多项血细胞参数。缺点：①不同的仪器使用的溶血素不同，形成不同的Hb衍生物，某些溶血剂形成的衍生物稳定性差，故应严格控制溶血剂的加入量及溶血时间。②有些溶血剂虽加入KCN,但衍生物并不是HiCN,而是氰化血红蛋白仪器需经过校正后才能进行Hb测定。③低色素性贫血、某些肝病等，由于RBC具有抵抗溶血剂的作用，导致RBC溶血不完全而影响Hb测定。【正常参考值】成人男：120～160g/L成人女:110～150g/L新生儿:170～200g/L【临床意义】贫血诊断优于RBC.Hb120g/L,（女，110）轻度，Hb90g/L,中度Hb60g/L,重度Hb30g/L,极重度【质量控制】1.技术误差：稀释倍数尽量准确，分光光度计波、比色杯光径要经常校正，以减少技术误差。2.HiCN转化液：应置棕色瓶中，不得使用塑料容器，以防CN-丢失。3.HiCN参考液：是制备标准曲线、计算K值、校正仪器及其他测定方法的关键物质，ICSH公布严格的规格和制备方法。国产标准品已有供应