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组织切片染色技术1学习目标掌握：染色、常规染色的概念；HE染色的基本步骤。熟悉：染色的目的、原理；常用染色术语；染色前后的处理；苏木素-伊红染色液的配制。了解：染色的注意事项。2染色概述第一节3一、染色的概念就是利用染料在组织切片上给予颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。染色是制片过程中的一个重要环节4二、染色的目的将染料配制成溶液将组织切片浸入染色剂内经一定的时间，组织或细胞及其他异常的成分被染上不同深浅的颜色对光产生不同的折射率便于在光镜下观察。5染色的物理作用(1）毛细管作用及渗透作用染色剂与组织细胞没有牢固的结合(2)吸收作用：又称溶解学说。组织吸收染色剂，牢固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同。三、染色原理6(3)吸附作用是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液(染液)中吸附一些小颗粒(化合物或离子)到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。三、染色原理7染色的化学作用染色剂按性质可分为酸性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内一般也可区分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分)较牢固地结合。三、染色原理8例如，细胞核（尤其是核内的染色质）主要由核酸组成，是酸性的组成成分，故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红)的亲和力很大，易于着色。9进行性染色和退行性染色进行性染色：组织成分着色由浅至深，当达到所需要的强度时，终止染色。此种方法无需“分化”，例如，卡红染色。退行性染色：是先把组织浓染过度，超过所需的程度，然后再用某些溶液脱去多余的染色剂，以达到适当的深度，并使不应着色的组织细胞脱色。这个步骤称为“分化”。三、染色原理10直接染色，间接染色和媒染剂直接染色：染色无需第三种物质参加，染色剂和组织即可直接结合着色。间接染色：单独染料本身的水溶液或酒精溶液，几乎不能与组织细胞结合或结合的能力很弱，必须有第三种成分——媒染剂参与，才能使染色剂与组织细胞有效地结合起来。媒染剂：通常是双价或三价金属如铝、铁的硫酸盐或氧化物。媒染剂在染色中起着架桥作用，既能与染料结合又能与组织相结合，达到了促进染色的效果。三、染色原理11促染剂用以加强染料和组织细胞结合能力的物质称为促染剂促染剂如化学反应中的催化剂，少量存在就有明显的促染作用。它们的作用机制也许是降低表面张力或是改变了染液的pH值。三、染色原理12分化剂在退行性染色中，附在组织细胞上多余的染色剂需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脱去，从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比，同时使目的物本身的色泽也深浅适当。这种选择性地除去多余染色剂的过程称为“分化”，所使用的溶液即“分化剂”。有酸性分化剂、氧化分化剂、媒染分化剂三、染色原理13变色反应和正色反应变色反应：染色反应最后目的物所呈现的颜色和染色剂当初的颜色不同。如：黏液用甲苯胺蓝可染成红色，而其余组织则染成不同色调的蓝色。正色反应：染色反应最后目的物所呈现的颜色和染色剂的颜色相同。如：酸性品红总是将组织染成不同色调的红色；淡绿染成不同色调的绿色。三、染色原理14四、染色剂（一）染色剂染色的化学基础染色剂分子能够显示颜色的基因，称为发色团。主要的发色团有：－N=N，－N=O，C=O，C=C偶氮基亚硝基羰基烯基含有发色团的苯环化合物，称为色原。苯+发色团=色原染色剂分子中还需具备促使染色剂与组织细胞相结合的基因，这样基因又称为助色团。如—NH2—COOH—OH—SO3H氨基羧基羟基磺酸基15四、染色剂（二）染色剂的分类1．按来源分2．按主要用途分3．按染色剂分子中的发色团分4．按染色剂的化学性质分16四、染色剂1．按来源分（1）天然染色剂：苏木素、胭脂红、地衣红和番红花。（2）合成染色剂：从煤焦油中提取的苯衍生物。无机化合物，如硝酸银、氯化金、磺、锇酸和高锰酸钾等。17四、染色剂2．按主要用途分（1）胞核染色剂：苏木素、胭脂红、甲苯胺蓝、美蓝和孔雀绿等。（2）胞质染色剂：伊红、淡绿、橘黄G、酸性品红和苦味酸等。（3）脂质染色剂：苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、苏丹黑、硫酸尼罗蓝和油红等。18四、染色剂3．按染色剂分子中的发色团分（1）亚硝基类：发色团为亚硝基（-NO)，如萘酚缘-B。（2）硝基染料：发色团是硝基（-NO2），如苦味酸。（3）偶氮类：发色团为偶氮基（-N=N-），属于这一类的染色剂有橘黄G、刚果红、俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。（4）醌亚胺类：含有两个发色团，一个是印胺基（-N=）、一个是醌型苯环，如硫堇、美蓝、甲苯胺蓝O、硫酸尼罗蓝、中性红和碱性藏红花O、焦油紫等。（5）苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘、浅绿、碱性品红、酸性品红、结晶紫和甲基缘等。（6）山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁和伊红Y等。（7）蒽醌染料：此类染色剂含有色原蒽醌，如茜素和胭脂虫酸。（8）噻唑类（9）喹啉类使用极少19四、染色剂4．按染色剂的化学性质分（1）酸性染色剂：色原-助色团-Na→[色原-助色团]+Na+。常用的如伊红、酸性品红、苦味酸、橘黄G、刚果红、水溶性苯胺蓝和淡绿等酸性染料常用以染细胞质等碱性成份。（2）碱性染色剂：色原-助色团-Cl→[色原-助色团]++Cl。常用的如苏木素、卡红、次甲基蓝、甲苯胺蓝、硫堇和美蓝等碱性染料常用以染细胞核等酸性成份。20五、常用染色术语1．普通染色在组织制片技术中，常规制片最广泛应用的是苏木精和伊红染色，又称为常规染色（HE染色）。2．特殊染色特殊染色就是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分，是常规染色的必要补充，也是染色技术中不可缺少的部分。它在病理诊断中起到辅助作用。3．单一染色选用一种染料进行的染色，如用铁苏木素染睾丸生精细胞等。4．复染色用两种不同性质的染料进行染色的方法，如用苏木素和伊红分别使细胞核及胞质染成两种颜色。5．多种染色选用两种以上的染料的染色，如Mosson三色染色法。21六、染色前后处理（一）染色前处理1．脱蜡至水二甲苯Ⅰ10min，37℃二甲苯Ⅱ10min，37℃无水乙醇2min无水乙醇2min95％乙醇2min85％乙醇2min75％乙醇2min流水冲洗22六、染色前后处理2．除去汞盐沉淀物对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10min），脱碘（5%硫代硫酸钠）→流水洗→染色。23六、染色前后处理3．脱甲醛色素（1）浓氨水1ml，75%乙醇200ml。切片脱蜡后置溶液中30min或较久→流水洗→染色。（2）1%氢氧化钾1ml，80%乙醇100ml。切片脱蜡后置溶液中10min→流水洗5min→80%乙醇5min→蒸馏水洗→染色。24六、染色前后处理4．除铬沉着物组织用含铬的Zenker氏液等固定的，有铬沉淀物。除铬沉着物可应用盐酸乙醇溶液，或用5%碘酒和5%硫代硫酸钠水溶液处理。25六、染色前后处理（二）染色后的处理1．脱水95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min。2．透明二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min透明。3．封固通常用中性树胶或加拿大树胶加盖玻片封固。26七、染色的注意事项1．切片脱蜡应彻底。2．常规染色、特殊染色等，组织要进行固定处理，做酶反应的组织固定更应严格。凡用含升汞固定液固定的组织，切片脱蜡后，应经脱汞处理，同时要慎防切片脱落。3．各种染料试剂一般选用化学纯。各种染料启用新品时应先试染。配成的染液、试液应盛于有色试剂瓶内，瓶签应写明名称、含量、配制年月日，顺序保存于避光橱中，必要者放冰箱内。凡须临用时配制者，配量应适当。4．染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响，可根据镜下观察所见酌情予以调整。5．染色过程中，勿使切片干燥。染色完毕后用显微镜检查染色结果是否符合要求，并核对标本种类、号码、数量是否无误。27常规染色第二节28一、常规染色的概念在组织制片技术中，常规制片最广泛应用的是苏木精和伊红染色，称为常规染色（HE染色），又称普通染色。29二、苏木素-伊红染色液的配制（一）苏木素染液的配制方法常用的有：1.哈瑞氏（harris）苏木素染液最常应用染色时间为5min∽10min配制①蒸馏水1000ml②苏木素3g∽5g③碘酸钠1g④钾明矾50g∽80g⑤水醋酸20ml其优点是：配后即可应用染色力较强。其缺点是：极易产生金属膜沉淀。30二、苏木素-伊红染色液的配制2.埃利希（Ehrlich），苏木素染液配制①无水乙醇100ml②甘油100ml③苏木精2g④钾明矾2g∽3g⑤醋酸5ml∽10ml置于阳光下自然氧化3个月左右成熟。其优点是：染色结果甚佳，贮存愈久染色愈强，而且不需分色。31二、苏木素-伊红染色液的配制（二）分化液1％盐酸酒精，是最常用的分化液。配方：70％酒精99ml浓盐酸1ml32二、苏木素-伊红染色液的配制（三）还原液1．氢氧化氨液：配方：浓氨水1ml蒸馏水99ml2．饱和碳酸锂液：配制：碳酸锂1g蒸馏水（冷）78ml3．流水冲洗还原。33二、苏木素-伊红染色液的配制（四）伊红染液配方：伊红Y（水溶）0.5g∽lg蒸馏水99ml若取用伊红Y（醇溶性）应溶于99ml75％或95％的乙醇中。若在伊红液中加入0.5毫升冰醋酸，可加速其染色过程，并使胞质的色泽更为艳丽。34三、染色方法苏木精伊红嗜碱性结构：细胞核粗面内质网游离核糖体等嗜酸性结构：细胞质基质溶酶体、线粒体等细胞器胶原纤维等35常规脱蜡苏木素染色（5-15min），水洗盐酸乙醇溶液分化（30s），水洗伊红染色（1-3min），水洗氨水反蓝（30s），水洗90%乙醇（5min）80%乙醇（30s）100%乙醇（2次×10min）二甲苯（3次×5min）封片染色脱水透明封片脱蜡染色的时间，应根据室温，及组织的具体情况来确定，做之前做预实验。3637在染色后，重新进入酒精和二甲苯，最后用中性树胶封片，以便长期保存。*切片:固定→梯度酒精上行→二甲苯→石蜡。*染色:石蜡→二甲苯→梯度酒精下行→水。*保存:水→梯度酒精→二甲苯→中性树胶。38*苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性。39*伊红是酸性染料，粉红色。可以将大多数细胞的细胞质染成红色。被伊红着色的结构本身为碱性，具有嗜酸性。*不易被苏木素和伊红着色的结构具有嗜中性。40石蜡切片&HE染色4142四、染色注意事项1．组织切片的脱蜡应彻底2．苏木素染液使用一段时间后应及时更换新液3．染色时间的长短需依据染色剂对组织的染色作用、室温条件、切片厚薄、固定液类别和染液的新旧而进行相应调节。434．分化十分重要。5．还原液不宜过浓6．伊红宜淡染，复染过深胞核会不清晰，影响镜检。7．脱水、透明宜彻底448．要将组织四周的污染物去掉9．封固剂要适量10．染好的切片标签贴牢，编号清楚，避光保存4546