组织病理学制片技术

德江县人民医院病理科1病理技术的应用帮助临床查明死因(尸检);手术后病变标本，明确诊断(临床活检);为教学、科研提供资料;取材(Samplecollection)→固定(Fixation)→脱水(Dehydration)→透明(Transparentizing)→浸蜡(Paraffinsoaking)→包埋(Embedding)第一节组织处理1.人为因素2.标本大小3.取材时间4.包埋方向5.边缘标记一、取材(Samplescollection)6.小标本的处理方法7.特殊情况取材8.取材数量9.清除多余成分10.重复取材11.核对取材12.剩余组织存放二、固定(Fixation)固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。(一)固定的目的1.迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变成不溶性物质，并保持原有的空间位置。3.固定剂有硬化作用,增加组织的硬度,便于制片。4.组织中的各种物质经固定后产生对染料的亲和力，利于染色和观察。（二）常用的固定方法1.浸泡固定法2.灌注固定法3.细胞涂片的固定方法4.微波固定法5.蒸气固定法（三）常用的固定液1.单纯固定液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸(picricacid)(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(aceticacid)2.混合固定液(1)Bouin液：用于结缔组织及脂肪染色；(2)Zenker液：常用于三色染色；(3)4%多聚甲醛-磷酸二氢钠-氢氧化钠液；（四）固定时的注意事项1.标本应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。特殊标本应单独固定和存放。2.固定液的用量一般固定液用量为组织块体积的10~20倍，贵重的固定液不少于3~5倍。3.防止组织变形柔软或较薄的组织先平铺在吸水纸上，再投入固定剂中；含气或脂肪多的组织易浮于液面，可在组织表面覆盖棉花以达到充分固定。4.固定液的穿透性一般固定液在24h内不能穿透厚度大于2~3mm的实体组织或5mm的多孔疏松组织，故取材组织块的厚度原则上不应超过3~4mm。5.固定时间固定的时间与固定液的种类、组织类型、块大小、温度等有关。一般1.5cm×1.5cm×0.2~0.3cm大小的组织块,固定时间为12~24h。6.固定温度大多数可在室温(25℃)固定，在低温(如4℃)固定时，固定时间要相应延长。三、脱水(Dehydration)组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般采用梯度脱水法。也就是使脱水剂的浓度逐渐升高，脱水过程尽量缓和，减少组织变形。四、透明(Transparentizing)常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。目前也有用环己酮作为透明剂，环己酮为无色无毒液体，可与苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蜡。而且脱水时组织不收缩变硬，用于快速石蜡切片效果较好。五、浸蜡(Paraffinwaxsoaking)用熔化的切片石蜡逐渐替换组织中二甲苯的过程。六、组织的包埋和包埋方法(Embedding)（一）常规石蜡包埋（二）脱落细胞标本的包埋（三）微小标本的包埋第二节组织切片法(Tissuesectioning)组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀机等。一、组织切片机和切片刀1.石蜡切片机2.火棉胶切片机3.恒冷箱切片机4.震动切片机•石蜡切片机•震动切片机•恒冷箱切片机切片刀切片刀是切片机的重要部件，常见的有两种：一种为可重复使用的钢刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20～24cm等，根据切片刀的形态，有平凹型、深平凹型、平楔型、双凹型。另一种为一次性钢刀片，是一种薄型切片刀片，用于普通石蜡切片。使用时固定在特制的刀架上。石蜡切片机用一次性钢刀片二、组织切片(Tissuesectioning)石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。(一)切片前的准备1.备齐常用器具,如玻片、毛笔和铅笔或刻字笔。2.检查切片机的工作状态,将固件都拧紧，检查切片刀是否锋利,切片刀质量是保证切片的关键。如果使用一次性刀片,应根据切片情况及时调整刀刃位置。（二）切片制作过程1.蜡块在冰箱中预冷，然后固定在切片机上。将切片刀装在刀架上。调整蜡块与刀的位置，使蜡块切面与刀刃接近。2.切片机多为轮转式，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，标本过小时修块应多加注意，大标本要切全。切出蜡带后，用毛笔轻轻挑起一端，用镊子夹起另一端，正面向上放入展片水槽中(水温一般低于蜡熔点10~12℃)，待切片展平后，即可进行捞片。3.切片时刀是由下向上运动，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织的表皮部分，胃肠等组织的浆膜面等)。4.捞片时注意组织片的摆放位置，尽量整齐美观。要留出贴标签的空间，5.捞片时注意在切片和玻片之间不要留有气泡。捞好的切片应在60℃左右烤箱内烤至少30min。以防染色时脱片。（三）石蜡切片制作时的注意事项1.组织的取材和固定；2.组织脱水、透明和浸蜡；3.切片组织块固定不牢时；4.切片刀和切片机；5.特殊要求切片的制作。第三节冰冻切片法冰冻切片可用于新鲜组织、甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。已固定的组织块经流水冲洗后再进行切片。冰冻切片法恒冷箱切片机提前开机预冷，一般工作温度设定在-22℃左右。待刀台、样品台和箱内达到设置温度后即可切片。顺序如下：①将组织用OCT粘在样品托后放置在速冻台上；②组织冻结后，将样品托固定到样品台上；③调整组织切面与刀刃位置，初步修出组织切面后，放下防卷板，关闭观察窗，开始切片。④切出的切片粘贴到载玻片上，直接冻存或吹干固定。取材负责诊断的医师应亲自检查大体标本，做多切面详细检查，必要时可在解剖镜下观察。选取最具代表性的组织制片，必要时应多点取材。如切面有特殊要求，应向技术人员说明。取材和切片的剩余组织须进一步做石蜡切片进行对照，有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的水平。第四节脱落细胞制片技术脱落细胞标本包括：胸水、腹水、尿液、脑脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的细胞，在临床上具有非常重要的诊断价值。一、细胞标本的取材细胞标本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活细胞标本的制备等。(一)印片法常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病灶中心剖开，将载片轻压于切面上，吹干后立即浸入固定液内5~l0min，取出自然干燥，低温储存。优点是操作简单，细胞抗原保存好。(二)穿刺液沉淀法常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，穿剌液少，可直接涂片，细胞尽量涂均匀。穿刺液多，细胞丰富，可置离心管内，以500rpm低速离心5~l0min，弃上清，将沉淀制成细胞悬液(2×105细胞/ml)。涂片镜检,以细胞较密不重叠为好。干燥后固定。胸水、腹水、尿液和脑脊液等如细胞较少时，也可用此方法制片。此法细胞保存好，操作简单。注意涂片时，尽量涂均匀。•2020/4/17•42宫颈脱落细胞涂片见分化不良细胞体积大、核深染；正常上皮细胞核小、胞浆丰富。谢谢大家！