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PCR实验室基本要求1.1.1PCR实验室基本要求2.1PCR实验室依据所使用的方法可分为试剂准备、标本制备、扩增、产物分析等三或四个区域。只是使用实时荧光PCR仪、HIV病毒载量测定仪的PCR实验室�有上述前面三个区域即可。各区域应完全独立分隔�不应有任何的空气直通。BasedonthemethodsusedbyPCRlab,thePCRlaboratorycanbedividedintothreeorfourroomsorareasfor(i)reagentpreparation,(ii)samplepreparation,(iii)amplificationarea,and(iv)productanalysisarea.IfthePCRlaboratoryonlyusesreal-timefluorescencePCRinstrumentsand/orinstrumentsforHIVvirusload,thePCRlabmayhaveonlythefirstthreeroomsorareas(reagentpreparation,samplepreparation,amplification).TheroomsorareasofthePCRlabshouldbeindependentlyseparated,andthereisnoairflowthroughtheseparatedroomsorareas.2.2产物分析区或三个区域的最后一个区域�即扩增及产物分析区��空气流向应由室外向室内�可通过在室内设置通风橱、排风扇或其他排风系统达到空气流由室外向室内流动的要求。ForPCRproductanalysisareaorlastareaofthreeareas(areaforamplificationandproductanalysis),directionofairflowshallbefromoutsidetoinsideoftheareabysettingupfumehood,exhaustfanorotherexhaustsysteminthearea.2.3PCR实验室各区域仪器设备配备通常如下�TheequipmentconfigurationforPCRlabsareasfollows:2.3.1试剂准备区:Reagentpreparationarea仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。Themainequipmenthereshouldbe:pipette,refrigerator,balance,lowspeedcentrifuge,vortexmixer,mobileUVlamp,etc.ItcanuseLaminarflowcabinetforthereagentpreparation.2.3.2标本制备区samplepreparationarea仪器设备主要应有生物安全柜�最好为B2,可避免提取核酸在柜内反复循环�造成标本间交叉“污染”�出现假阳性结果。此外还应配备加样器、台式高速离心机�冷冻及常温�、台式低速离心机、恒温设备�水浴和/或干浴仪�、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。Themainequipmentisthebio-safetycabinet(typeB2isbetter,becauseitcanavoidrecyclingofnucleicacidcabinetandcrosscontaminationofspecimens).Besides,itshallbeequippedwithpipettes,centrifugetablehighspeed(refrigeratedandnormaltemperature),centrifugetablelowspeed,constanttemperaturedevices(waterbathordrybath),refrigerator,vortexmixerandmobilelampUVetc.2.3.3扩增区amplificationarea主要仪器就是核酸扩增热循环仪�PCR仪�实时荧光或普通的�。热循环仪的电源应专用�并配备一个稳压电源或UPS�以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外�根据工作需要�还可配备加样器、超净台等。Themainequipmenthereisathermalcyclersystemfornucleicacidamplification(PCR,quantitativefluorescencedetectionorcommon).PowerforthethermalcyclershallbeprovidedwithamanostatoraUPStoavoidtheinfluenceonPCRamplificationarosebyfluctuationofvoltage.Moreover,dependingontheworkdemand,theamplificationareacouldbeequippedwithpipette,ultracleancabinet,etc.2.3.4产物分析区�PCRproductanalysisarea本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪�槽�、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、DNA测序仪、酶标仪和洗板机等。Theequipmentheremaybepipette,electrophoresissystemcapillary,transblotsystem,chest/ovenmoleculehybridization,waterbath,DNAsequencer,microplate-readerforELISA,microplatewasherandsoon.建议Recommendations在理想情况下�PCR实验室试剂准备、标本制备、扩增三个区域可设置缓冲间。在缓冲间内�可设置正压�使室内空气不流向室外�室外空气不流向室内。Inanoptimalsituation,forthreerooms(reagentpreparation,samplepreparation,amplification)ofthePCRlabonebufferareacouldbesetup.Thepressureinthebufferareashouldbepositivetoassuretheindooraircouldnotflowtooutsideandtheoutsideaircouldnotflowtotheinside.PCR实验室平面布置示意图一般实验室间隔材料分:彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上,主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行一般实验室间隔材料分:彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上,主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行**卫生部PCR研究员李金明(卫生部临床检验中心临床免疫室主任,研究员)的PCR建设方案再说吧�国外的资料不一定是最好。个人觉得李金明的实验室区正压�扩增分析区因为没有缓冲�所以为负压��缓冲间负压的作法可以更好的防止气体的外泄及防止试剂准备区、标本制备区、产物扩增区、扩增分析区四区之间的气体相互渗漏。PCR实验室也可以分为三个区�即第三、四区合为一区�必须设立缓冲间。有条件建设实验室采用三十万级的标准来建设。空调系统采用制冷剂各区独立循环�可以防止气流交叉。**疾病预防控制中心实验室建设之PCR实验室基本要求:PCR实验室可以是分散形式�也可以是组合形式。完成一组PCR实验�通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程�若实验工艺需要�还应增加样品粉碎过程。一、分散形式PCR实验室所谓分散形式PCR实验室�是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远�呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR实验室�由于各个实验之间不易相互干扰�因此无需特殊条件要求。二、组合形式PCR实验室所谓组合形式PCR实验室,是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置�组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室�由于各个实验间集中布置�容易造成相互干扰�因此�对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间�以减少室内外空气交换。试剂配制室及样品处理室宜呈微正压�以防外界含核酸气溶胶的空气进入�造成污染�核酸扩增室及产物分析室应呈微负压�以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品。如果使用荧光PCR仪�扩增室和产物分析室可以合并。若房间进深允许�可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面�缓冲间比专用走廊更有意义。**PCR实验区的设置�几个要注意的问题�1、几个区域的大小设置情况�应该是试剂准备区、产物扩增区、扩增分析区�要小一些。标本制备区应大一些。因为�标本制备室要放置一个生物安全柜为一个低温冰箱。2、试剂准备区、标本制备区就设立紧急洗眼器�以备不时之需。3、PCR实验室的洁净度可以根据用户的实际使用情况和资金的投入来设计。**临床基因扩增检验实验室基本设置标准根据《临床检验扩增检验实验室管理暂行办法》�制定本标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则�一�临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和准备区2、标本制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪�区域可适当合并。�二�各工作区域必须有明确的标记�避免不同工作区域内的设备、物品混用。�三�进入各工作区域必须严格按照单一方向进行�即试剂储存和准备区—标本制备区—扩增反应混合物配制和扩增区—扩增产物分析区。�四�不同的工作区域使用不同的工作服�例如不同的颜色�。工作人员离开各工作区域时�不得将工作服带出。二、工作区域仪器设备配置标准�一�试剂储存和准备区1、2-8C和-15C冰箱2、混匀器3、微量加样器�覆盖1-1000ul�4、移动紫外灯�近工作台面�5、消耗品�一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头�带滤心�6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品�二�标本制备区1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器�覆盖1-1000ul�6、可移动紫外灯�近工作台面�7、超净工作台8、消耗品�一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头�带滤心�9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子DNA�应具有超声波水浴仪。�三�扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器�覆盖1-1000ul�3、可移动紫外灯�近工作台面�4、消耗品�一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头�带滤心�5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品(四)扩增产物分析区视检验方法不同而定。基本仪器设备如下�1、微量加样器�覆盖1-1000ul�2、可移动紫外灯�近工作台面�3、消耗品�一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头�带滤心�4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备�在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施�1�PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。2�组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理�以根据应用的需要提取DNA或RNA。3�用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具�也不能用作操作靶序列。4�DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作�以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。5�大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。6�管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生�而且管子不能用力崩开�这样会产生气溶胶。7�任何时候都应该穿实验服和带手套�手套要经常更换�尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间�经常清洗。