酶的分离纯化.

酶的分离纯化提取原则a.相似相溶。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。酶的提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶酶的分离方法1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐使酶或杂质从溶液中析出沉淀从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S(Svedbergunit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。微滤，推动力是压力差，分离机理为筛分超滤，同上纳滤，同上，分离机理为优先吸附和表面电位反渗透，同上，分离机理为优先吸附和溶解扩散4层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。层析法的分类流动相有两种状态：*液体作为流动相*气体作为流动相固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分类：液相层析液-固层析液-液层析气相层析气-固层析气-液层析按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。洗脱剂的选择要注意下列各点：◇洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解。◇洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。◇洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响。分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。交换层析（ionexchangechromatography，IEC）1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。离子1）离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。化学原料合成：树脂类物质载体天然材料制成：cellulosesephadexsepharose阳离子交换剂:电荷基团（－）,反离子（＋）电荷基团阴离子交换剂:电荷基团（＋）,反离子（－）两种离子交换剂阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基CM—CH2COO－磺丙基SP—C3H6SO3－离子交换剂的选择a.强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广，制备无离子水弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质b.阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性若pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。常用的凝胶：葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。6、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取各种双水相系统聚合物P聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠3.6酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异调节溶解度：沉淀法2.根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤3.根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳4.根据专一性结合的方法：亲和层析5.其它：吸附层析，疏水层析二、纯化方案的评价（一）酶活力测定：酶活力(enzymeactivity)又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率。常用的方法：1.化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。2.分光光度法：利用底物和产物光吸收性质的不同。3.量气法：酶促反应中产物或底物之一为气体。4.滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。常用终止反应方法：1）改变反应最适条件：加酸、碱、加热2）加酶变性剂：5％三氯乙酸酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。但在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。常用比活力表示酶制剂的纯度：酶活力（u/ml）比活力＝————————————————蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）（二）蛋白质浓度测定1.紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。2.双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速缺点：灵敏度差3.酚试剂（Folin-酚）测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。4.染料结合法（考马斯亮蓝染色法（三）提纯倍数与回收率:酶的比活力(纯度)=活力单