微生物大小与数量的测定实验报告

山东大学实验报告2017年11月27日_________________________________________________________________科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康一、目的要求1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。2.增强微生物细胞大小的感性认识。3.明确血细胞计数板计数的原理。4.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、基本原理一）微生物大小的测定1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每格长0.01mm（即10µm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于矫正目镜测微尺每格的相对长度。3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8µm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3µm。二）微生物数量的测定1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。2.用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上3.各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。（本次试验所用血球计数板为25个中方格）4.计数时，通常数随机五个不相邻中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。5.设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，所以对于25个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数n=A/5×25×10^4×B=50000A·B（个）。血球计数板三、器材1.菌种：大肠杆菌7d鞋面培养物，酿酒酵母24h液体合成培养基培养物。2.仪器或其他用具：目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜，移液枪，血球计数板等。四、操作步骤一）微生物大小的测定1.装目镜测微尺取出右目镜，把目镜上的透镜片旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。2.校正目镜测微尺（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。（2）校正先用低倍镜观察，将镜面测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。（3）计算由于已知镜台测微尺每格长10µm，根据下列公式即可分别计算处在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（µm）=用上述方法分别对低倍镜、高背景和油镜进行校正，分别测出在低倍镜、高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数，并用上述公式计算出不同倍镜下目镜测微尺每格所代表的长度。（观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。）3.菌体大小的测定目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到菌体后，换油镜测定大肠杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出大肠杆菌宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。测定酵母菌时，先将酵母菌培养物制成水浸片，然后用高倍镜测出宽和长各占目镜微尺的格数，最后，将测得的格数乘上目镜微尺（用高倍镜时）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小；可选择有代表性的3~5个细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差。4.测定完毕取出目镜测微尺后将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。二）微生物数量的测定1.菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。2．镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。3．加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用换上新枪头的移液枪移取少量摇匀的酿酒酵母菌悬液，之后由盖玻片边缘缓缓注入一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。（取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。）4．显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。5．清洗血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。之后镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求细菌每小格内约有5～10个菌体为宜，酵母菌每小格内约有2～6个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，可按照各人习惯记或者不记芽体，但要在结果中注明芽体数目是否算入。五、实验结果表8.1目镜测微尺的校准结果物镜类型放大倍数物镜测微尺每格长度目镜测微尺每格长度410μm50μm低倍镜1020μm高倍镜405μm油镜1002μm表8.2大肠杆菌和酵母菌菌体大小的测量结果大肠杆菌酵母菌123平均观察方式123平均观察方式长1.51.51.61.5油镜直径7877高倍镜宽1.01.01.01.0测量结果1.5×1.0μm测量结果7μm表8.3酵母菌数目的测定结果各中方格中菌数五中方格中总菌数A稀释倍数B每毫升菌液中菌数n12345464542554423255.8×10^7六、思考题(1)为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为目镜测微尺每一组的长度都是对应一个特定的放大倍数，在更换不同放大倍数的目镜或物镜之后，整个显微镜所观测到物体的整体放大倍数发生了改变，那么原来的目镜测微尺的标度就不再适用了，需要进行重新标定。(2)在不改变目镜和物镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一株细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：基本相同。因为细菌的大小是由其本身确定的，若使用不同的放大倍数测定同一株细菌，只要目镜测微尺的标定长度是正确的，那么所测得的结果就是大体相同的，不过因为不同放大倍数下读数的精确度不同以及读数时本身所存在的误差，可能会导致两次不同放大倍数下的测量结果和精确度有一定的差别。(3)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确?误差来源：①刻度不清晰导致读数不准；②浓度安排不合理导致过浓菌体有重叠或者过稀数据不准确；③菌液中混有杂质或气泡导致视野受阻；④视野中菌体分布不均匀，读数差别大，不准确等等。解决方案：①使用之前用水洗净并镜检确定没有污物；②滴加菌液时从盖玻片边缘滴加让其缓缓渗入；③滴加完菌液之后将血球计数板静置5min使菌体沉淀；④清理血球计数板时不可使用毛刷或者吸水纸，用冲洗后自然晾干；⑤读数时若发现菌体密度过稀或过浓应及时调整稀释倍数重新测量，以菌体数每小方格2-6个为宜（针对酵母菌来说）。(4)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。方案一：取适量酵母粉加入清水制成悬液，活化12h,加入美蓝染色10分钟，之后取少量菌液用血球计数板计数，分别记下总菌数以及活菌数（菌体呈无色），从而求得活菌成活率。方案二：同样取适量酵母粉制成悬液，先是用光电比浊法测得菌液中总菌数，之后阶梯稀释成不同浓度的菌液，分别涂布在麦芽琼脂平皿上，28℃培养3天，根据出现的菌落数和对应菌液的稀释倍数算出活菌数，两组数据结合求得该酵母粉中的活菌存活率。