4微生物发酵过程

Chapter4.微生物发酵过程(MicrobialFermentation-Process)一.微生物发酵的类型二.种子扩大培养三.发酵培养基四.发酵过程中间分析五.发酵终点的判断微生物发酵的不同类型微生物发酵需氧或不需要好氧发酵兼性发酵厌氧发酵培养基呈液态或固态液态发酵固态发酵发酵在培养基表面或深层进行表面发酵深层发酵间歇发酵或连续进行分批发酵补料分批发酵连续发酵菌种状态游离发酵固定化发酵单一或混合菌种单一纯种发酵双菌发酵混合发酵一.微生物发酵的类型如：黑曲霉发酵生产柠檬酸；棒状杆菌的Glu发酵；地衣芽胞杆菌发酵生产聚谷氨酸等如：乳酸杆菌的乳酸发酵；梭状芽孢杆菌的丙酮丁醉发酵等空气×√×√如，酵母厌氧产酒精；好氧积累菌体；另外，细胞固定化，生物法处理废水，细菌采矿等等;固定化细胞√×NextpageNextpage发酵形式优点缺点固体投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，广房面积大劳动强度发酵因地制宜，利用农副产品以及下脚料作为大不易机械化操作。原料进行生产。液体液体环境适合菌体生长和物质传递，发酵在均投资大，设备要求严格，发酵质条件下进行，便于控制，液体输送方便，易动力消耗比较大于机械化操作，产品易精制｡设备占地少，容量大，可自动控制，适合大规模生产。固体发酵和液体发酵的区别固态发酵和液体发酵是微生物发酵的两大技术领域，各具特征，并存在着明显的区别。固态发酵投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，因地制宜地利用农副产品以及下脚料作为原料进行生产。液体发酵适合菌体生长和物质传递，发酵在均质条件下进行，便于控制，液体输送方便易于机械化操作，产品易精制｡同时，液体发酵设备占地少，容量大，可自动化控制，适合大规模生产，具有很大的优势。但是，如能解决好固态发酵的设备问题，固态发酵也将会发挥出更大的作用。表面发酵和深层发酵表面培养法深层培养法放置曲盘需要更多的厂房利用密闭的发酵罐需要更多的劳动力相反利用抵押空气鼓风机需要高压空气动力消耗少空压机、搅拌耗能需要简单控制需要精密控制很少有污染问题污染往往成为严重问题产品回收包括水溶、抽提、相同过滤、离心、蒸发、沉淀相同微生物发酵分批发酵(BatchFermentation)补料分批发酵(Fed-batchFermentation)连续发酵(ContinuousFermentation)固态发酵(SolidStateFermentation)高密度发酵(HighCellDensityFermentation)基因工程菌的发酵(Recombinantstrainfermentation)发酵罐进行的间歇操作称为分批发酵。在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。分批发酵中菌体生长规律及生长参数的数学模型第七章已有详述。工艺变量随时间而变化是该发酵方式的主要特征。摇瓶培养也属分批发酵.分批发酵的主要设备是种子培养罐、主发酵罐、无菌供气系统和产物分离纯化系统。分批发酵的基本过程如图1.分批发酵(BatchFermentation)2.补料分批发酵(Fed-batchFermentation)以某种方式定时向培养系统补加一定营养物质的发酵方式称为补料分批发酵。它是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。定时补料的同时并不向外排放发酵液，所以使发酵系统不再封闭，且培养液体积随时间和物料流速而变化。由于营养底物缓慢补入，既满足微生物生长和产物合成的持续需要，又避免了由于底物基质过量所引起的各种调控反应。定时补充物料，可使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定的范围内，既保证了微生物生长，又不会产生不利影响，从而达到提高容量产率、产物浓度和得率的目的。补料技术可以采用少量多次、少次多量、流加或微机控制流加；整个发酵过程中不断地调节补料率，维持各项物质的供需平衡。根据补入物料的组成可将补料分批发酵分为完全补料发酵和半分批补料发酵。完全补料发酵是补入成分完全的培养基。半分批补料发酵是仅补入一种或几种限制性营养成分。3.连续发酵(ContinuousFermentation)连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。连续发酵的原理及恒化连续培养系统、恒浊连续培养系统在第七章已有所述。下图为典型的实验室连续发酵系统。连续发酵的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。4.固态发酵(SolidStateFermentation)固态发酵是指微生物在没有游离水或几乎没有游离水的较湿的固态培养基上的发酵过程。固态的湿培养基一般根据成分不同控制含水量在40-80％左右，无游离水流出。农村的堆肥、青饲料发酵和酿酒制曲，就是典型的固态发酵。特别是我国工艺历史悠久、国际著名的白酒生产都有自己独特的固态发酵工艺过程。由于固态发酵方式节能、环保，近来又得到了人们的青睐。如：以产朊假丝酵母（Candidautilis）、面包酵母（Saccharomycescerevisiae）和啤酒酵母（Saccharomycescarlsbergensis）为复合发酵菌种，以麸皮、大豆饼和少量脱毒棉籽饼为原料，经固态发酵法生产饲料蛋白添加剂得到快速发展。伴随着发酵工程机械化、自动化、化工技术和设备的改进，在传统固态发酵的基础上发展到现在的固态发酵。现代固态发酵与传统固态发酵的技术比较见下表现代固态发酵和传统固态发酵的比较性质现代固态发酵传统固态发酵反应器在密闭的固态发酵反应器中进行在极为简单的发酵容器中进行或敞口式固态发酵菌种采用单一纯种菌株或混合菌株发酵基本是自然富集发酵或强化菌种发酵范围扩大了固态发酵的运用范围限于传统食品的生产能耗操作能耗高，设备投资较大操作能耗低，设备投资小，劳动强度大原料需要无菌处理发酵原料可直接利用价格低廉的粮食和纤维素原料，分离适宜于分离纯化高附加值产品产品处理一般较简单，可直接烘干固态发酵生物活性物质生理活性物质微生物底物伴孢晶体（细菌内毒素）苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis)椰子果渣赤霉素藤仓赤菌(Gibberellafujikuroi)，串珠镰孢(Fusariummoniliforme)麸皮，玉米穗，木薯粉，甘蔗渣等赭曲毒素赭曲霉(A.ochraceus)，鲜绿曲霉(P.viridicatum)大麦，大米，玉米土霉素龟裂链霉菌(Streptomyces,rimosus)玉米穗麦角类生物碱串珠镰孢(Fusariummoniliforme)甘蔗渣头孢霉素顶头孢霉(Cephalosporiumacremonium)大麦粒头丙菌素带小棒链霉菌(Streptomycesclavuligerus)向日葵种子枯草菌溶血素枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)豆渣环孢素丝状真菌(Tolypocladiuminflatum)麸皮抗真菌素枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)黏土及稻草复合培养基绿僵菌素金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)大米糠固体发酵和液体发酵的区别性质固态发酵液体发酵培养基中水分及营养物浓度培养基中没有游离水的流动，水是培养基中较低的组分，微生物从湿的固态基质吸收营养物，营养物浓度存在梯度培养基中始终有游离水的流动，水是培养基的主要成分，微生物从溶解水中吸收营养物，营养物浓度始终不存在梯度培养体系状态和营养物扩散培养体系涉及到气，液，固三相，气相是连续相，而液相不是连续相；颗粒内的混合难以实现，且微生物的生长受营养扩散的限制培养体系大多只涉及气，液两相，而固定相所占比例低，是悬浮在液相中，液相为连续相；可实现有效混合，营养扩散通常不受限制接种和供氧问题接种比比较大，大于10%；在需要大量供氧过程中，空气通过固体层的阻力较小，能量消耗少，接种比比较小，小于10%；在好氧发酵中，需要克服静液层阻力才能将氧通过深的液层。消耗能量大系统压力和能耗由于系统压力低，所需通气的压力低；微生物所需氧主要来自气相，只需少量无菌空气，能耗低由于需要克服液位差和气体从气相到液相的阻力，系统需要较高气源压力；微生物所需氧来自于溶解氧，需要消耗较大能耗用于微生物溶解氧需求代谢热量排除和代谢热去除气体循环和通气不仅可提供氧气和排除挥发性产物，而且也排除代谢热量；代谢热去除比较困难，主要依靠通气蒸发冷却，易造成局部水分缺乏气体循环和通气仅仅提供氧气和排除挥发性产物，代谢热量需要冷却水排除；代谢热驱除比较容易通过冷却水控制，不存在通气造成水分缺乏微生物生长基质和底物浓度微生物吸附于固态底物的表面生长或渗透到固态底物内生长；高底物浓度可以生产高的产物浓度微生物均匀分布在培养体系中；高底物浓度产生非牛顿流体问题，需要补料系统发酵均匀度和发酵结束产物浓度发酵不均匀，菌体的生长，对营养物的吸收和代谢产物的分泌在各处都是不均匀；发酵结束时，培养基是湿物料状态，产物浓度高发酵均匀；发酵结束时，培养基是液体状态，产物浓度低产物提取和生产率由于产物量高，提取工艺简单可控，因此没有大量有机废液产生，但是提取物含有底物成分；使用浓缩的培养基和较小的固态发酵生物反应器，因此生产率高，而得率和生长速率低需要去除大量高浓度废水，分离设备的体积通常很庞大，费用高，而产物纯化比较容易；使用稀释的培养基和较大体积的生物反应器，因此生产率较低发酵温度度控制有效去除代谢热困难，易出现过热问题高水含量使发酵温度控制容易，发酵设备庞大原料加工一般发酵原料需要经过较复杂的加工，消耗能量大一般发酵原料需要经过较复杂的加工，消耗能量大液体表面积以及生长适用范围固态发酵中固态颗粒提供的液体表面积比深层液体发酵中气泡提供的界面高很多；固体培养基的水活度在0.99以下，适宜于水活度在0.93-0.98的微生物生长，限制了运用范围，同时也限制了某些杂菌生长通过深的液层，消耗能量大；适用于大多数微生物的生长设备现代化程度和发酵在线检测所需设备不完善，缺乏在线传感器，机械化程度低，产品不稳定，重复性差；由于缺乏有效在线测量手段，过程控制比较困难所需设备完善，自动化程度高，技术比较成熟；许多在线传感器的成熟，可以实现发酵过程控制生长环境和发酵环境模拟自然生长环境，使微生物保持与自然界相似的生长状态；微生物是接近于自然状态下的生长，有可能产生一些通常液体发酵中不产生的酶和其他代谢产物，如霉菌毒素，分生孢子等；固态发酵微环境利于微生物分化，特别是丝状真菌分化代谢在人工液体培养基中均匀生长；液态发酵环境抑制微生物分化代谢，不利于次生代谢产物生产5.高密度发酵(HighCellDensityFermentation)微生物代谢产物的合成完全是靠菌体作为生产者来实现的。菌体量越多产物的产量也越大。因此，通过发酵工程实现高密度微生物细胞培养则是发酵的最终要求。采用一定的工艺技术实现了高密度发酵，它不仅使发酵液的菌体浓度比分批发酵提高了10倍以上，而且使菌体的生产能力也处于最佳状态，并能消除有害代谢物对菌体正常发酵的影响。高密度发酵较分批发酵有显著的技术优势。表15-4列举了几种微生物的高密度发酵结果。菌种基础培养基发酵罐补料方法细胞干重(g/L)培养时间(h)大肠杆菌葡萄糖矿物搅拌罐葡萄糖（甘油）140-15030-40盐或甘油矿物盐非限制指数补料枯草杆菌含葡萄糖的完全搅拌罐补料分批培养18530培养基补加葡萄糖调节pH毕氏酵母葡萄糖，矿物盐搅拌罐补料分批培养，10050-120补加甲醇高细胞密度发酵成功的实例高密度发酵生物反应器有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器等。日本人铃木等用搅拌陶瓷膜反应器系统实现乳酸杆菌高密度培养，其陶瓷过滤器可从发酵液中去除抑制生长的代谢副产物。日本人内野等采用内外两个圆筒的膜透析反应器，能连续去除抑制性代谢产物，始终保持菌体生长繁殖