酶的固定化

第四章酶的固定化酶应用过程中的一些不足酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。固定化技术一、固定化酶的概念固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。水不溶性载体水溶性酶固定化技术水不溶性酶（固相酶）结合酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续酶的固定化技术和固定化酶固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：1.极易将固定化酶与底物、产物分开；2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；4.酶反应过程能够加以严格控制；5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；6.较游离酶更适合于多酶反应；7.可以增加产物的收率，提高产物的质量；8.酶的使用效率提高，成本降低。缺点：1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损失；2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化酶颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降;3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilizedenzyme。二、固定化酶的研究历史随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。1)、固定化酶操作的注意事项三、酶的固定化方法原则和注意事项2)、制备固定化酶遵循基本原则：（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。（2）固定化应该有利于生产自动化、连续化。（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。（4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于重复使用。（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括为四种类型：1.吸附法；2.结合法；3.交联法;4.包埋法四、酶的固定化方法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法。1.吸附法吸附法常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、羟基磷灰石等。优点：操作简便，条件温和，不引起酶失活，载体廉价，而且可反复使用。缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。吸附法（1）常用载体无机物有机物高分子化合物活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶淀粉麸质、大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶（2）固定化酶的制备机理所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。（3）优缺点优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构;方法简单，成本低。缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应吸附法固定化酶举例载体固定化酶活性炭α－淀粉酶、β－淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化铝葡萄糖氧化酶碳酸钙凝胶亮氨酸氨肽酶纤维素胰蛋白酶、核糖核酸酶麸素Β－淀粉液化酶硅胶磷酸化酶2.结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为共价结合法和离子结合法。离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化。共价键结合法酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。（1）酶与载体反应的主要功能基团游离羟基：肽链C－末端的α–羧基，天门冬酰氨酸，谷氨酸的β－γ羧基游离氨基：肽链N－末端的δ－氨基，赖氨酸ε－氨基巯基：半胱氨酸羟基：丝氨酸，苏氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：组氨酸共价键结合法（2）所用载体重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷化法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素）含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）共价键结合法（3）固定化酶的制备机理将与载体反应的功能基团与各种重氮化剂、烷化剂等反应形成共价键制备固定化酶。纤维素+盐酸甲醇CMC－甲酯＋肼CMC－酰肼CMC－叠氮化物＋NH2酶亚硫酸钠盐酸＋固定化酶－CH2CO-NH酶CMC－CH2COOH制备酰肼叠氮化物羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序共价键结合法（4）优缺点优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长时间使用。缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏离子键结合法酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶（1）所用载体纤维素的衍生物，离子交换树脂（2）固定化酶的制备机理酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。（3）优缺点优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落第一个离子结合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexA-50固定化氨基酰化酶3.交联法借助双功能试剂使酶分子间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。常用的双功能试剂有：戊二醛、己二胺等、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在载体表面。常用载体：硅胶、离子交换树脂。交联法酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联•酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶优点:结合牢固,可以长时间使用.缺点:反应条件剧烈，酶活力损失大，制备成的固定化酶颗粒较小，使用不方便。4.包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法。凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。包埋法酶液丙烯酰胺N，N－双丙烯酰胺氢气催化剂：四甲基乙二胺、明矾胺引聚剂：过硫酸钾、核黄素光照聚合反应凝胶酶块固定化酶切割凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）凝胶或膜酶聚丙烯酰胺凝胶α、β－淀粉酶葡萄糖氧化酶乳酸脱氢酶淀粉胆碱酯酶琼脂青霉素酰胺酶制备的固定化酶微型胶囊法（1）原理把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。特点微囊直径几微米～几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内表面聚合法以亲水性单体和疏水性单体在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶。分三步：常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类亲水性单体疏水性单体生成的聚合物聚胺聚异氰衍生物聚胺、聚酯乙二醇、多元醇聚异氰衍生物聚胺、聚酯（3）方法——表面聚合法、液中干燥法、相分离法A乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。B表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。三步：C清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体。1微型胶囊法形成的固定化酶胶囊制法囊膜的素材应用的酶表面聚合法尼龙乳糖酶羧基脱氢酶聚合脲天门冬酰胺酶液中干燥法聚苯乙烯过氧化氢酶脂肪酶脲酶相分离法火棉胶过氧化氢酶天门冬酰胺酶硝酸纤维素天门冬酰胺酶缺点：单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防治酶的失活和变性。优点：A制备条件温和，制得的胶囊不易变化。B能很好地保存天然酶的活性和特性。C大小可任意调节，制备时间短。微型胶囊法优缺点首先被采用包埋法的是：•固定化胰蛋白酶•木瓜蛋白酶•－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂举例：制备珠状聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶乳糖酶（100g）溶解在磷酸缓冲液中，取1mL酶缓冲液，加入丙烯酰胺单体和N-N′-甲叉双丙烯酰胺的溶液中，再加入二甲氨基丙腈，过硫酸钾作引发剂，混合10分钟，得到含酶的凝胶孔径。海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控脂质体包裹优点：反应条件温和，很少改变酶结构，包埋在高聚物内的方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适