急性肝损伤模型的建立

大鼠急性肝损伤的动物模型前景•目前,肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫性、化学性等方法,生物学方法要求实验条件高且费用昂贵,限制了应用。•免疫方法是造成免疫肝损伤,主要用于通过免疫机制而抗肝损伤的药物研究。如：卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)诱导法、刀豆蛋白A诱导法。•化学方法则是通过化学性肝毒物质,如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。•这里我们以四氯化碳性肝损伤模型的建立来浅谈一下。实验目的1.掌握四氯化碳对肝脏的毒性机理，成功建立其急性肝损伤模型。2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相关问题，真正感受造模的过程，为将来真正进入实验做铺垫。四氯化碳性肝损伤的机制关于CCl4肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经肝微粒体细胞色素P450代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2和Cl)及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4的代谢产物能迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA等多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自由基作用于DNA时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA链的断裂或DNA链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊乱,引起肝细胞损伤加剧。四氯化碳性肝损伤的机制1引起氧化应激氧化应激在CCl4引发肝损伤的早期发挥着重要作用。(1)引起自由基变化;(2)引发与COX介导的炎症反应相关;(3)导致肝星形细胞活化。2引起体内相关酶系变化(1)转氨酶上升。CCl4引发肝实质损害时,天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶活力升高,且酶活力的高低与肝细胞受损的程度相一致。(2)酶性抗氧化物改变。它们具有强烈的清除自由基的作用,且互相依赖和支持,形成网络式的抗氧化酶系统来拮抗CCl4对肝脏造成的损伤。(3)细胞色素P450酶系改变。CYP450酶在CCl4肝损伤发生过程中起到了十分重要的作用,以CYP2E1最为受到关注。3改变细胞因子活性CCl4引发机体产生的脂质过氧化产物,如丙二醛和42羟基壬醛,可引发转化生长因子2β1、TNF2α,白细胞介素等细胞因子的高表达,后者在CCl4诱导的肝纤维化的过程中发挥着重要作用。4引起细胞凋亡CCl4引发机体产生的自由基的代谢紊乱会引起脂质过氧化产物的积累,进而促进肝细胞的直接死亡或者凋亡。其中,羟基自由基是促使肝细胞凋亡的重要体内物质。CCl4引发肝细胞凋亡的机制复杂,一般认为都是通过激活死亡受体实现的。另外,CCl4也可引起肝星形细胞的凋亡。CCl4可激活核因子2κB,引起细胞凋亡。5毒性基因组学变化近年来,国内外很多学者运用基因芯片技术对CCl4的毒性机制进行了探讨,初步形成了CCl4的基因组学研究体系。CCl4急性肝损伤实验表明,6和24h是CCl4的损伤阶段,而48h至2周则是CCl4后引发损伤后的自我修复阶段；CCl4慢性肝损伤试验表明,30～60d阶段作为脂肪变性期,60～90d为肝纤维化形成期。建立模型方法急性肝功能衰竭模型：a.腹腔注射法：采用Wistar或SD大鼠，重200±10g，约20只大鼠。实验组：用四氯化碳(CCl4)溶于精致植物油,配成浓度为10%、20%或更高40%的四氯化碳，予3-10ml/kg分组腹腔注射给药，12～24h（更早或更晚）后处死动物。取材，检测指标。对照组：予相同剂量的精致植物油腹腔注射，余同上。b.皮下注射法：颈背部或后肢外侧皮下注射，拔针是要注意药液外漏。c.灌胃染毒法：试验前对动物隔夜禁食。成模的标准（1）血液：测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红质(TB)、总蛋白(TP)、白蛋白(A)血清等。a.肝组织样品处理血清:以3500转/分离心15～20min,取上清夜低温保存,于一周内检测完.b.肝样:取011g加1mL生理盐水匀浆,以3500转/分离心15～20min,取上清夜低温保存,于一周内检测完.（2）组织病理学检查取材：a.时间：分组给药后3h、6h、12h、24h。b.固定：取肝脏将其固定于4%（10%）甲醛中,经常规脱水,石蜡包埋,切5μm厚切片,常规HE染色、Masson染色和Ret2culin染色,光镜下观察。四氯化碳性肝损伤的关键点1.急性肝损伤是一个短期过程，一般在12-48h内成模，因此，分组建模、取材、标本固定的时间安排等很重要。2.腹腔注射CCl4溶液，要注意进针部位、深度。对给药浓度和剂量，因为鼠源不同或相关文献数据的不一致性，可以分组进行不同剂量、浓度的对比性实验。3.在制模过程中可以加入戊巴比妥或乙醇代替饮水，以加速肝损伤进程。总结目前选用鼠造模的较多,因鼠繁殖力强,生命力旺盛,价格低廉;也有选用兔,因兔血容量大,肝脏大小适中,其肝损伤易于生化及影像学观察。给药途径有多种,如皮下注射、腹腔注射、灌胃、蒸气吸入或拌于食物中快速口服等,优劣各家说法不一。灌胃法CCl4经过门静脉系统吸收,直接进入肝脏,模型制备理想,但操作复杂,肠道反应大;腹腔内注射门静脉浓度高,肝损伤形成时间短,但病死率较高(20%～35%);皮下注射较腹腔注射具有如下缺点,造模周期长,动物病死率高,相应增加了实验经费,因操作不当可以发生皮下渗漏,但操作简便;蒸气吸入需快速吸入,呼吸道刺激大,动物不耐受,中枢毒性大,易污染环境和伤害实验人员;溶于少许食物快速口服,少吃多餐,挥发减少,浓度低胃肠刺激减小,但受动物食欲影响,剂量难以掌握,实验终点不明确,周期长。