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第二章DNA重组克隆的单元操作2014年2月本章节内容DNA重组的载体(装载DNA的工具）DNA的体外重组（切、连）重组DNA分子的转化与扩增（转、增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检测）目的基因的克隆（供体中的目标DNA的克隆）第一节DNA重组的载体质粒载体λ双链噬菌体DNA载体M13单链噬菌体DNA载体噬菌体-质粒杂合载体载体的功能为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞中的复制、扩增或整合能力（指DNA拷贝数的增加）（所有载体必须具备的能力）为外源基因提供在受体细胞中的表达能力（指基因的表达，使外源基因通过mRNA和蛋白质在受体细胞中发挥功能，进而可发现基因在生物体内发挥的作用）。载体必须具备的三个条件具有复制原点或整合位点，能使外源基因在受体细胞中稳定遗传。既有多种单一的核酸内切酶的识别切割位点（多克隆位点，multi-clonesite,MCS)。具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测。一、质粒载体（一）质粒的基本性质存在于细菌或真菌的细胞质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价、闭环，双链DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。大多数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞复制周期质粒（一）质粒的基本性质质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。选择性标记(selectablemarker):由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒.一、质粒载体（一）质粒的基本性质1、质粒的自主复制性：含有Ori或replicon质粒在特定的宿主细胞中维持恒定的拷贝数。A、反义RNA进行调控的机制B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理一、质粒载体A、反义RNA进行调控的机制（plasmidColE1）RopdimerPRNAIIRNAIIa、在复制起点处，RNAII（长555个碱基）与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H可降解RNAII，露出3’自由羟基，质粒复制起始。在该区域还能反向转录形成RNAI，I和II为互补的RNA。B、如果RNAI和RNAII形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNAII，复制不能进行。RopdimerPRNAIIRNAIIc、当质粒的浓度比较高的时，Rop蛋白促进RNAI和RNAII形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。d、当质粒的比较低时，RNAII与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNAII质粒复制起始。e、突变RNAI或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理（pS101质粒）a)复制原点区域含有3～7拷贝的长度为17～22bp的重复区域，R1、R2、R3等。B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理b)复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋白。RepA是双功能的蛋白：与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。如果质粒拷贝数高，RepA蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复制受到抑制。RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低，RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA的合成。B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理问题：在寄主复制后，质粒是如何分配到子细胞中？Par原件会附着在细胞膜上，随着细胞的分裂，质粒正确分配到子细胞中，维持相对稳定的质粒拷贝数。（一）质粒的基本性质2、质粒的可扩增性（质粒的拷贝数）拷贝数：细胞中质粒的数量（摩尔数）与染色体DNA数量之比严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1~几个）松弛型:多个拷贝存在于细胞中（≥10）严谨型与松弛型是相对的。（一）质粒的基本性质3、不相容性在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性，或称为不亲和性（Plasmidincom-patibility)。这样的两种质粒称为不亲和质粒（一）质粒的基本性质引起质粒的不相容的机理A具有相同的复制调控机制B控制质粒分配的par元件相同,也会引起质粒的不相容不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1（一）质粒的基本性质4、质粒的可转移性（p13)（二）、质粒的改造和构建天然的野生质粒一般不能直接用作克隆载体，需要改造1、删除不必要的DNA序列，缩小质粒相对分子量，提高外源DNA片段的装载量。2、灭活一些质粒的基因（如可转移基因），保证重组实验的安全；灭活质粒拷贝数的负控制基因，提高质粒的拷贝数。3、加入选择性标记，便于重组子的检测4、加入多克隆位点，便于外源基因的插入5、根据克隆的目的，加装特殊的表达元件或便于蛋白纯化的元件（GST标签）R7268ApRR1drd19ApRCmRSmRSuRKmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApRTcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApRTcR78pMB1(b)例:第一个人工构建的遗传载体pBR322（三）、质粒的分类及用途1、克隆质粒：能在宿主细胞中高拷贝存在（含有氯霉素可扩增的松弛型复制子或解除了对质粒拷贝数的负控制作用）。2、测序质粒:能高拷贝复制，含有MCS，含有通用的引物序列（如SP6，T7），能形成单链模板，便于测序反应的进行。3、整合质粒：含有整合酶编码基因以及整合特异性位点序列，克隆在这种质粒上的外援基因进入受体细胞后，能准确重新整合在染色体DNA的特点位点上（如动物植物细胞中用于目的基因敲除的载体，见第五章、第六章）。BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII（三）、质粒的分类及用途4、穿梭载体（shuttlevector）质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。如大肠杆菌-酵母穿梭质粒。特点：克隆在这类载体上的外源基因不需要更换载体直接从一种受体菌转入另一种受体菌复制并且遗传。三、质粒的分类及用途5、探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。无启动子序列（三）、质粒的分类及用途6、表达质粒在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。如pET载体。常用的载体见表格2-1（p16)MCS复制原点选择标记高效启动子终止子序列核糖体结合位点pGEM载体—克隆DNA的体外转录加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚合酶或SP6T7噬菌体的RNA聚合酶的识别方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA加工，合成蛋白质等的研究等6、表达质粒pGEM-3Z多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如E.coliBL21（DE3）等AproripGEM-3Z2743bplacZ’PT7MCSPSP6（四）、质粒DNA的制备1基于分子大小的分离2基于构象的分离质粒有三种构型cccDNA(共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的。ocDNA(开环DNA)：只有一条链是完整的。线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解。超螺旋DNA松弛cccDNA开环DNA核酸内切酶DNA连接酶核酸内切酶DNA促旋酶拓扑异构酶碱变性用CsCl-EB等密度离心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)电泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ总结质粒载体1、质粒载体的基本性质：自我复制能力、拷贝数的控制、严谨型和松弛型质粒、质粒的不相容性及机理2、质粒载体具备的特点3、质粒载体的分类：克隆载体、测序载体、穿梭载体、表达载体和探针载体等的特点（一）、噬菌体的生物学特征λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp。基因簇集排列线λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期线性λ噬菌体两端各有12个碱基的5’凸出黏性末端是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。作用：进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。二、λ双链噬菌体DNA载体1、对野生λ噬菌体的改进A、删除多余的限制性内切酶的位点。B、切除一些非必需序列，增加载体的容量。C、设计阳性选择重组子的方法。D、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。（二）、基于λ噬菌体的克隆载体2、λ噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力λ噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环（二）、基于λ噬菌体的克隆载体3、重组噬菌体的鉴别（1）lacZ′基因功能选择方法类似于质粒中的蓝白斑筛选（2）cI基因功能选择法cI插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常的噬菌斑是“浑浊”的浑浊清亮3、重组噬菌体的鉴别（3）Spi-（sensitivetoP2inhibition）正选择A野生型λ噬菌体，不能在P2噬菌体溶源性细菌中生长，为Spi+，即对在P2噬菌体的抑制呈敏感反应。Bλ噬菌体载体中的red和gam区段被外源片段取代后，λ噬菌体就能在P2噬菌体溶源性细菌中生长。3、重组噬菌体的鉴别（4）、基于λ基因组大小的筛选包装体系只能将大小37~52Kb的DNA分子插入到噬菌体的头部结构中插入型载体通常删除了噬菌体的中非必须的基因部分，因此中有重组后介于37~52Kb的分子才能被包装。（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。失去了非必需区切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA（三）、λ噬菌体载体分类两种报告基因的插入型载体cI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感染hfⅠ-大肠杆菌后可形成空斑（如λgt10）。在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoRⅠ酶切位点。在此处插入外源基因，可表达β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库(如λZAPII)（三）、λ噬菌体载体分类cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A取代型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间