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第四章植物细胞和动物细胞培养反应器第一节植物细胞培养反应器一、植物细胞培养过程的特点1．细胞培养液的特性植物细胞比微生物细胞大50－100倍，体积大约要膨大105－106倍，在培养液中所占体积可高达40－50%，而酵母一般只有5%左右，培养过程中培养液的黏度可增大30倍。2．植物细胞培养中的传递状态植物细胞由于体积较大，比表面积比微生物小得多，耗氧速率一般也比微生物小得多，如烟草细胞培养中最大值为0.6mmol/g.h，而微生物则在1.5－8mmol/g.h。所以KLα不必太大，KLα过大未必对细胞增殖有好处，有人推测可能是KLα过高，更容易使CO2从培养液中排出，如果在培养过程中通入CO2，则KLα大对细胞的增殖有效。二、植物细胞培养反应器1．悬浮培养生物反应器1）机械搅拌式反应器2）非机械搅拌式反应器2．固定化细胞生物反应器1）填充床反应器2）流化床反应器3）膜反应器机械搅拌式反应器机械搅拌式反应器是最传统的微生物发酵装置，同样也可用于植物细胞悬浮培养。机械搅拌式反应器已成功地用于许多细胞的培养中，而且也具有反应器内的温度、pH、溶氧及营养物浓度较其他反应器更易控制等优点，但由于剪切力大。易对植物细胞造成较大损伤，对次级代谢产物的合成也会产生影响。机械搅拌式反应器设计要点：要选用该类反应器，除需要筛选出抗剪切力的细胞系外，对反应器结构进行适当改造，尤其是搅拌浆的结构和类型的改进，使其具有缓和的、但又充分的搅拌效果。非机械搅拌式反应器优点：由于没有活动的搅拌装置，剪切力小，对细胞损伤小，而且容易实现长期无菌培养。缺点：操作弹性小，低气速时尤其在培养后期植物细胞密度较高时，混合效果较差。如果提高通气量，又会产生大量泡沫，严重影响植物细胞的生长。此时一种较为有效的方法是添加消泡剂。此外，对这类反应器缺乏足够的经验，放大过程也不如机械搅拌式反应器成熟设计要点：在气体搅拌式反应器中，氧传递系数KLa受流体动力学的影响很小，其变化主要取决于单位体积的气液表面积，而表面积值又取决于气泡的大小和持气率。气泡的大小又与气体分布器设计、流型以及培养基的聚结抑制特性相关，持气率通常与界面气体速有关。增加气体流速便增加了气体持有量和KLa。但是气体流速的增加受到泡沫等问题的限制。必要时，可通过修改反应器内部结构以促进氧传递。非机械搅拌式反应器填充床反应器填充床生物反应器中，细胞固定于支持物（胶粒、泡沫、金属颗粒或连的网）表面或内部，细胞固定支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动，通过培养液流动实现混合和传质。填充床生物反应器缺点在于：混合效率低，使必要的氧传递、pH值、温度的控制和产物的排泄很困难；填充床中颗粒或支持物的破碎会阻塞液体流动；用于固定的胶粒在高压下容易变形，会导致填充床阻塞。●传质效率低和阻塞是填充床生物反应器需要解决的关键问题。流化床生物反应器流化床生物反应器中，细胞包裹于胶粒、金属或泡沫颗粒中成为固定化植物细胞，通过培养液自下而上在反应器内的流动使固定化细胞呈流态化悬浮状态，培养液与植物细胞充分接触，混合程度高，传质传热效果好。流化床生物反应器缺点在于：●剪切力和颗粒碰撞会破坏固定化细胞；●流体动力学复杂使其放大困难。膜生物反应器膜式反应器是近年来生物反应器研究的重要领域，也是近年来广泛使用的一种固定化反应器。膜固定化是采用具有一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞。营养物质可以通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养液中。膜生物反应器最常用的是中空纤维和螺旋式卷绕反应器。膜生物反应器用于植物细胞培养一方面可以维持较高的细胞浓度。同时又可以将细胞产物不断地从反应体系中分离出去(对于胞外产物)，降低了产物的反馈抑制，提高了生产效率。但是这种反应器的传质效率低，同样具有容易堵塞的问题，而且投资较大。膜反应器膜反应器植物细胞培养反应器的放大一般认为：植物细胞培养反应器的放大过程可以以相同体积溶氧传递系数KLa为依据。同时考虑合理的搅拌强度。整个反应器放大过程需要在充分了解大型反应器内流体流动、传热、传质规律上进行。植物细胞反应器的选择和设计植物细胞反应器的选择和设计的基本原则如下。(1)氧的供给对于间歇培养体积溶氧系数KLa需要10—15h-1左右。(2)剪切力：植物细胞对剪切力非常敏感，要求反应器的剪切力尽可能小。(3)细胞的黏附：细胞培养过程中细胞容易黏附在反应器壁上，并产生大量的泡沫，导致细胞量和代谢产物减少；严重时培养过程被迫终止。(4)细胞高浓度培养时，混合情况变差，培养基中营养物质和氧的供给不足，细胞收率下降，鼓泡式反应器容易发生上述情况；(5)温度、PH值、营养物质的浓度需要控制在合适的范围内。植物细胞的生物反应器培养存在的问题植物细胞在放大培养过程中，产物量往往小于次一级反应器，而且次生代谢产物合成能力也会降低许多，可能是由下列因素引起。(1)通气和搅拌引起的流体压力对细胞或积聚体造成细胞损伤、有益气体的散失、大量泡沫的生成等，这些都会对细胞生长和产物积累产生影响。(2)高密度引起培养液黏度增加，造成细胞对营养、气体传递的抑制。(3)反映器设计缺陷，如死角等部位细胞黏附引起的细胞死亡、腐败、营养和气体吸收限制等，搅拌浆类型缺陷或通气方式等。(4)对产物积累相关机制、途径等(尤其是营养与环境条件)尚不是非常清楚，因此很难维持最佳培养条件。由于上述因素的存在，截至目前，只有极少数的植物细胞培养实现了工业化，如两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺等。植物细胞反应器的未来研究方向①适应于不同植物细胞培养的新型生物反应器以及细胞生长和次级代谢产物生成的动力学模型的研究；②提高反应器的空间利用率及反应器中接种的自动化程度和反应均匀程度；③不同植物细胞反应器系统的放大规律；④植物细胞反应器培养过程中的优化控制等。三、植物组织培养反应器植物次生代谢产物的合成常与植物细胞的分化程度有关。因此利用高度分化的植物器官、组织培养以提高目的产物含量的研究日益引起人们的重视。植物组织培养及反应器浅层循环式植株快速繁殖器第二节动物细胞培养反应器绝大部分的生物技术药物都是动物细胞产品（已超过80%），因此动物细胞大规模培养技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培养过程生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。动物细胞（体外培养）分：√非贴壁依赖性细胞：来源于血液、淋巴组织细胞。（杂交瘤细胞）√贴壁依赖性细胞：大多数动物细胞(Vero、Hela、CHO、BHK)一、培养方法1．贴壁培养大多数动物细胞需要附着于带正电荷的固体或半固体表面的特性。细胞贴壁过程最初采用滚瓶培养。VanWezel在1967年开发了一种微载体系统培养壁依赖性细胞。微载体是直径为60－250um的微珠。细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐生长成单层，具有单层培养和悬浮培养的优点。玻璃微珠集合了单层培养和悬浮培养，具有许多优点：1）表面积/体积比大2）细胞生长环境均匀3）培养基利用率高4）采样重演性好5）收获过程不复杂6）放大较容易7）劳动强度小，占用空间小。贴壁培养的缺点：占表面积大，放大困难；不能有效监测细胞的生长；难以达到培养环境的均一化。2．悬浮培养是指细胞在培养容器中自由悬浮生长的培养方式。适用于一些来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞以及某些转化细胞等非贴壁依赖性细胞。动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上建立起来的，但由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈搅拌和通气时产生的剪切力，因而又与经典的发酵不同。3．固定化培养是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附（与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理形成细胞絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法将细胞固定在支持物上，或形成细胞絮结，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁依赖性细胞均适用。对非贴壁依赖性细胞常用海藻钙包埋；对贴壁依赖性细胞常用胶原包埋。二、细胞培养的操作方式1、分批式操作2、流加式操作3、半连续式操作4、连续操作5、灌注培养三、动物细胞大规模培养反应器所谓动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(rollerbottle)、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有气升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。八十年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞，生长缓慢，对培养环境十分敏感。采用传统的生物化工技术进行动物细胞大量培养，除了要满足培养过程必需的营养要求外，有必要建立合理的控制模型，进行pH和溶氧（DO）的最佳控制。细胞生物反应器可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞培养液中的pH值和溶氧水平，使系统始终处于最佳状态，以满足动物细胞的生长对pH值和溶解氧的需要。如可改变通入培养罐内气体中氧气和氮气的比例来实现控制DO值的目的;采用二氧化碳/碳酸氢钠（CO2/NaHCO3）缓冲液系统来控制培养液的pH值是一种较好的方法。1．通气搅拌式细胞培养反应器由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈搅拌和通气，因此要求搅拌转动时产生的剪切力小，混合性好，主要用到笼式通气搅拌器。笼式通气搅拌器气泡用丝网隔开，避免在向培养基通气时损伤细胞。同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。笼式优点：流体混合好，剪切力小，能较好适合微载体系统培养动物细胞的要求。缺点：溶氧系数小，不能满足高密度细胞的耗氧要求；气路系统不能就地灭菌。2．气升动物细胞培养反应器该系统具有以下几个优点：1）没有移动部件；2）完全密封；3）便于无菌操作；4）不易污染；5）设计简单；6）氧的转换率高。3．中空纤维细胞培养反应器中空纤维是用聚矾或聚丙烯制成。管壁的厚度约50－75um，直径200um，管壁是半透膜，一个培养筒内由数千根中空纤维组成，然后封存在特制的圆筒内，这样就形成了2个空间，，纤维管内为“内室”，可灌流无血清培养液供细胞生长，管间隙为“外室”，接种细胞就贴附于“外室”的管壁上，并吸取从“内室”渗透来的营养，迅速生长繁殖。由于细胞分泌物的分子量大而无法透过半透膜到“内室”，只能留在“外室”不断被浓缩，当收集产物时，只要把管间“外室”的总出口打开就可获取产物。而代谢物由于分子量小，可以从管壁渗透到“内室”，最后从“内室”总出口排出，不会对“外室”的细胞产生毒害作用。用途：即可培养悬浮生长细胞，又可培养贴壁依赖性细胞。4．微囊培养系统微囊技术：把生物活性物质、完整的活细胞或组织包在薄的半透膜中。微囊的制备：在无菌条件下，将活性细胞或生物活性成分悬浮在1.4%海藻酸钠溶液中，通过特制的成滴器将含有细胞的悬液形成一定大小的小滴，滴入CaCl2中，形成内含活性细胞或生物活性成分的凝胶小珠，再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸聚合物包被，形成坚韧多孔可通透的外膜。重新液化胶化物使其流出，活性细胞或生物活性成分则留在多孔膜内，放入气升式发酵罐内培养。微囊技术特点：1）细胞密度大2）产物单位体积浓度高3）分离纯化操作经济方便4）抗体活性、纯度高5．大载体系统大载体是由海藻酸钠构成。海藻酸钠含有重复排列的葡糖醛酸和甘露