沙门氏菌检测

食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验巢国祥博士GB/T4789.4-2010：15852880556：[e-mail]沙门氏菌简介„DANIELELMERSALMON,(1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。1884年任美国农业部畜牧局首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以他的名字命名的。™沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。沙门氏菌是一群形态、培养、生化反应和抗原结构相类似的革兰氏阴性杆菌，它广泛存在于人类和动物（猪、牛、羊、鸡、鸭）及鼠类的肠道、内脏与肌肉。沙门菌（Salmonella）沙门菌（Salmonella）¾目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。¾肠热症：是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。¾急性肠炎(食物中毒):是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等引起。近几年来沙门氏菌引起的食物中毒为细菌性食物中毒的第2位，次于副溶血性弧菌的食物中毒。¾败血症：常由猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等引起。大小0.6～1.0×2～3um，无芽胞，一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为35～37℃，最适pH值为6.8～7.8。沙门菌生物学性状不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇(VP)，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。沙门菌生物学性状沙门氏菌检验MicrobiologicalexaminationoffoodhygieneExaminationofsalmonella（GB/T4789.4-2010）致病菌分离鉴定的通用程序™增菌培养前增菌选择性增菌™分离鉴定™生化鉴定™血清学鉴定沙门氏菌检验流程沙门氏菌检验流程前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力;BPW选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制;SC+TTB选择性平板分离培养：BS+XLD/HE/显色培基生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱，可采用API20E等成套生化试剂血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种。实验仪器和材料培养基和试剂1.前增菌BPW的作用:使亚致死状态（如在冷冻状态、受到各种损伤）的细菌恢复，而增加检出率。BPW中的蛋白胨对亚致死菌有修复、恢复作用。注意：前增菌时间不可太长—充分理解8-18h的含义冷冻产品处理要掌握好时间2.选择性增菌选择性增菌液的作用：通过增加增菌剂有利于沙门氏菌生长，并通过抑菌剂的作用而抑制其它细菌生长。TTB(四硫磺酸钠煌绿)的作用:其选择性作用在于硫代硫酸钠与碘的平衡，碘液的加入量要严格计算，要当时配制使用（该增菌液的成分比较复杂）。SC(亚硒酸盐胱胺酸)的成分及作用:可能是亚硒酸钠与胱胺酸中的硫形成硒硫化物形成较好的选择作用。国际上常用的沙门氏菌增菌培养基有3种，即：(1)亚硒酸盐增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液，(2)四硫磺酸盐增菌液或四硫磺酸盐孔雀绿增菌液，(3)氯化镁孔雀绿增菌液。现行的国家标准采用了(1)亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)，和(2)四硫磺酸盐孔雀绿增菌液(TTB)。3.分离™BS的作用原理：选择性最强，为首选选择性分离培养基。沙门氏菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原为硫化铋，形成黑色菌落，周围有黑色和棕色环，对光观察有金属光泽。™XLD作用原理：中等选择性，与HE类似。™HE作用原理：中等选择性，其H2S指示系统较好。™科玛嘉：中等选择性，其显紫色与其它菌易于鉴别。缺点价格较贵BS36℃40-48h其他36℃18-24h沙门氏菌属各群在选则性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌亚硫酸铋琼脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有此菌株不产生硫化氢，形成灰色绿色的菌落，周围培养基不变色。XLD琼脂菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心ＨＥ琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色显色培养基沙门氏菌紫色(直径约1mm),柠檬酸杆菌属蓝色(直径约1mm),变形杆菌无色或被抑制显色培养基的发展™20世纪70年代末，法国微生物学家Rambach采用该技术研制出大肠菌群固体显色培养基，后来由他创立的CHROMagar公司研制开发了其他系列显色培养基，并形成了商业化产品。™显色培养基的产品发展简介：第一代产品：通过单一的颜色来区分单种的病原微生物，如Rambach琼脂、E.coli显色培养基。第二代产品：在同一个平板上通过多种不同的微生物可以形成不同菌落的颜色和形态差异，从而达到对样品中多种病原微生物分离和鉴定，如念珠菌显色培养基、弧菌显色培养基。第三代产品：通过在第二代显色培养基的基础上加入高特异性添加剂专一性的选择目标菌种（当前主要用于院内感染检测，用于分离耐药菌株与非耐药菌株）。如：MRSA、VRE、ESBL、KPC、Acinetobacter。原理在分离培养基中加入检测某些菌种的特异性酶底物,该底物为人工合成,由发色基团和微生物可代谢物质组成,通常为无色,但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色,直接观察菌落颜色即可对菌种做出鉴定。特异性酶促显色传统PH值显色沙门氏菌显色培养基——与传统沙门氏菌分离培养基的比沙门菌:一般为H2S(+),乳糖发酵(-),并产生碱性代谢传统培养基XLD,HE或SS含pH指示剂及铁化盐作为上述特性的检测。(i)由于一些菌种如柠檬酸杆菌(Citrobacter)及变形杆菌(Proteus)同样产生H2S及碱性代谢。假阳性（~30%）(ii)又一些沙门菌，如利文斯通沙门菌(S.livingstone),由于H2S(-)假阴性C-BSI-BSBS上的典型菌落C-HEI-HEHE上的菌落特征I-XLDXLD上的典型菌落科玛嘉平板上的典型菌落显色培养基XLDHE4.生化鉴定挑取可疑菌落TSI(斜面、底层、产气、H2S)蛋胨白水(靛基质)尿素(pH7.2)、KCN、赖氨酸反应序号:A1反应序号:A2反应序号:B1反应序号:A3、A4、B2、B3、B4甘露醇、山梨醇血清学试验鸟氨酸、ONPG、水杨苷、棉子糖、动力沙门氏菌血清学试验非沙门氏菌非沙门氏菌沙门氏菌报告三糖铁（三糖铁（TSITSI）反应模式及意义）反应模式及意义葡萄糖乳糖蔗糖说明+++分解糖类产酸→pH↓→指示剂变黄→斜面底层均产酸变黄记为A/A模式+--斜面因葡糖含量少故分解完后利用蛋白胨产碱且大于酸量故由黄而深红，记为K，底层无氧故缓慢分解葡糖而产酸变黄记为A，K/A模式++-+-+由于乳糖或蔗糖量大故斜面和底层均产酸变黄，亦为A/A模式•若分解硫化氢则产生黑色FeS沉淀，若分解糖类产气则可见气泡或裂缝•只有斜面和底层均产酸，且赖氨酸脱羧酶阴性者才可排除为沙门菌的可能性•其余情况既可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌三糖铁(TSI)的接种方法™取可疑菌落接种三糖铁等生化反应培养基™接种方法\TSI：先下层穿刺，后上层斜面划线\葡萄糖半固体培养基：穿刺接种™培养\37℃培养18～24h，观察结果细菌生理学检查法－－沙门氏菌的TSI试验三糖铁培养基结果观察\沙门氏菌：乳糖-，葡萄糖+，产气+/-，H2S+/-\志贺氏菌：乳糖-，葡萄糖+，产气-，H2S-标准管痢疾杆菌伤寒杆菌大肠杆菌肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种－＋＋/－＋沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌＋＋＋/－＋沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌－＋＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属－＋－－伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属＋＋＋/－－大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性™目的：通过不同细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌。™原理：细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基，生成胺和CO2，使培养基PH升高，指示剂显色。™常用氨基酸有三种：™赖氨酸：经赖氨酸脱羧酶生成尸胺和CO2。™鸟氨酸：经鸟氨酸脱羧酶生成腐胺和CO2。™精氨酸：经精氨酸脱羧酶生成精胺和CO2。™结果：检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照（无氨基酸）为黄色。赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验对照阳性（紫）阴性（黄）赖氨酸脱羧酶试验：其内含有少量葡萄糖及5倍于葡萄糖的赖氨酸，如果不利用赖氨酸只利用葡萄糖，为黄色。反之为深紫色。甲型副伤寒此试验为阴性4.1三糖铁与赖氨酸初筛尿素试验尿素试验™目的：通过检测尿素酶来进行肠杆菌科细菌的鉴定™原理：细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的氨，使培养基PH值升高，用酚红指示剂测出。™结果：培养基变红为阳性，不变为阴性。4.2沙门氏菌的初步鉴定靛基质试验阴性(液面黄)阳性(液面红)尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）靛基质试验靛基质试验™目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。™原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸生成的吲哚与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用生成红色的玫瑰吲哚。™方法：纯培养物接种蛋白胨水后35℃培养24-48h沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml观察。™结果：两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果A1＋－－－＋沙门氏菌属A2＋＋－－＋沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3＋－＋＋－弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4＋＋＋＋－普通变形杆菌B1－－－－－－－－＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2－－＋＋－－－＋－大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注3：＋表示阳性；－表示阴性；＋/－表示多数阳性，少数阴性。4.3沙门氏菌API鉴定及VITEK商品化生化鉴定系统™API20EAPI20E生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定法，广泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速鉴定。生化鉴定容易使用API20EAPI20E第1位数第2位数第3位数第4位数第5位数第6位数第7位数ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX124124124124124124124结果判定反应结果-+++++-----+++++-+-+-应得树枝024124000004124104020组合编码6704752沙门菌商品化生化鉴定系统VITEKGNI+应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。121=充填器2=封口器,条码阅读,自动上卡及卡片阅读/孵育功能VITEKVITEK全面菜单=API鉴定•准确率标准自动化金标准=™进行生化反应