2012年qPCR原理与分析方法

―qPCR系统从RNA提取到荧光定量800免费电话：800-810-2177内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介800免费电话：800-810-2177实时定量PCR技术的概念实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测800免费电话：800-810-2177实时荧光定量PCR技术涉及的概念扩增曲线荧光阈值Ct值800免费电话：800-810-2177扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件扩增曲线800免费电话：800-810-2177荧光信号的域值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值荧光域值800免费电话：800-810-2177Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt值800免费电话：800-810-2177横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性800免费电话：800-810-2177Ct值定量数学原理理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数800免费电话：800-810-2177Ct值定量数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率800免费电话：800-810-2177Ct值定量数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogM＝LogX0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）800免费电话：800-810-2177CyclenumberFlourescencCk104Ck102SampleCyclenumberLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系Ct值定量数学原理LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）800免费电话：800-810-2177mRNA表达的研究：如细胞因子、肿瘤耐药基因表达分析DNA拷贝数的定量：如易位基因的检测单核苷酸多态性（SNPs）分析基因型分析：杂合或纯合子临床检测：病毒感染的定量监测实时荧光定量PCR技术的应用800免费电话：800-810-2177内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介800免费电话：800-810-2177非特异性荧光标记：1.SYBRGreen特异性荧光标记：2.TaqMan3.MolecularBeacon常用荧光标记方法800免费电话：800-810-2177TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan方法800免费电话：800-810-2177TaqMan探针工作原理800免费电话：800-810-2177标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂分子信标(MolecularBeacon)800免费电话：800-810-2177800免费电话：800-810-2177SYBRGreen法反应示意图SYBRGreenSYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光800免费电话：800-810-2177SYBRGreen法SYBRGreen结合到DNA小沟部位示意图800免费电话：800-810-2177几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断MolecularBeacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析800免费电话：800-810-2177起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物SYBRGreen法的应用800免费电话：800-810-2177Sample25定量的方法Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量800免费电话：800-810-2177将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线—分析产物的特异性800免费电话：800-810-2177融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物融解曲线分析800免费电话：800-810-2177SYBR法实验流程及注意事项样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法800免费电话：800-810-2177样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法SYBR法实验流程及注意事项800免费电话：800-810-2177样品制备环境要求模板准备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的RNA分光光度计检测电泳检测800免费电话：800-810-2177RT反应体系优化试剂选择样品制备模板准备数据分析上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项800免费电话：800-810-2177模板准备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：100－200bp800免费电话：800-810-2177反应体系优化上机反应条件优化RT样品制备模板准备数据分析反应体积＞5ul，推荐20－50ulMg2＋调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90％－110％重复性：std＜0.2标准曲线：R＞0.99或R2＞0.98SYBR法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照800免费电话：800-810-2177技能要求误差控制仪器介绍上机试剂选择RT样品制备模板准备数据分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法实验流程及注意事项800免费电话：800-810-2177数据分析仪器介绍分析方法上机RT样品制备模板准备相对定量：2－△△Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确的数据SYBR法实验流程及注意事项800免费电话：800-810-2177内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介800免费电话：800-810-2177绝对定量简介标准样品的制备800免费电话：800-810-2177绝对定量简介拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v800免费电话：800-810-2177扩增效率（E）：扩增效率与标准曲线的斜率相关：E=10－1/斜率，理论的扩增效率理论值应该为2，即每一个循环的PCR产物都翻倍，那么2＝10－1/斜率，优化的标准曲线斜率应该为－3.32E用每个循环扩增模板百分比表示即：E％＝（E－1）×100％例如E＝1.95，那么E％＝（1.95－1）×100％，即每次循环有95％模板被扩增扩增效率概念绝对定量简介800免费电话：800-810-2177绝对定量举例：HBV病毒检测Sample:HBV阳性标准品，分别含有5×103、5×104、5×105、5×106copies/mlcopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone实验数据：绝对定量简介800免费电话：800-810-2177标准曲线制作举例扩增效率（E）计算E=10-1/斜率=10-1/-3.17=2.03E%=(2.03-1)×100%=103%标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52R2=0.9988152025305×1035×1045×1055×106CopiesCt800免费电话：800-810-2177标准曲线制作举例如未知样本Ct为20.5标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36=229087copiesy=-3.17x+37.52R2=0.9988152025305×1035×1045×1055×106CopiesCt800免费电话：800-810-2177内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介800免费电话：800-810-2177分析方法：2－△Ct2－△△CtPfaffi法相对定量简介应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化800免费电话：800-810-21772－△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化比率（处理后/处理前）＝2－Ct（处理后）－Ct（处理前）＝2－△Ct＝2－（16－18）＝42－△Ct法：假设扩增效率（E=10－1/斜率