T7E1

T7E1酶切法检测突变体实验步骤1、PCR扩增目的片段：PCR扩增出带有突变位点(如TALENorCRISPR/Cas9的targetsite)DNA片段，长度约500bp，突变位点最好不位于PCR片段中央，这样将切割出两条大小不同的带；PCR反应的具体体系及条件参考实际使用的PCR聚合酶使用说明。2、突变体DNA与野生型DNA的PCR产物（无需纯化处理）按如下体系混合于EP管中：编号123突变体DNAPCR产物5μL2.5μL0野生型DNAPCR产物02.5μL5μL10XT7E1Buffer1.1μL1.1μL1.1μLddH2O4.4μL4.4μL4.4μLTotal10.5μL3、加热变性、退火复性处理：两种方法处理，任选其一，如下：I、在1L的烧杯中加入500mL水，加热使其沸腾后，将步骤2中的EP管置于浮板上放入沸水中，停止加热，将烧杯置于室温，待其自然冷却至室温即可（此过程大约需1至1.5小时）II、使用PCR仪进行退火处理，设置程序如下95℃5min94℃2sec，-0.1℃/cycle,200times75℃1sec，-0.1℃/cycle,600times16℃2min4、T7E1酶切反应：上述反应体系分别加入0.5μLT7E1酶，37℃反应30min后，立刻加2μLDNALoadingBuffer（客户自备），混匀后65℃煮10min，跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。（放置时间过长可能会导致PCR产物全部降解）图.非配对内切酶法-T7E1法检测突变体的突变率。突变型带：大约300+200bp野生型带：大约500bp突变率=突变型带/(野生型带+突变型带)（按照带的灰度计算）阳性参照阳性参照可以分别单独PCR扩增后，PCR产物等量混合，或者混合DNA模板进行PCR扩增，PCR产物进行加热变性、退火复性处理后，使用T7E1酶切，产生400bp+200bp两个端片段。