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双向电泳sun1细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW58.44)130mM8g氯化钾(MW74.5)2.7mM0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW358)10mM3.63g磷酸二氢钾(MW136)2mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。Washingbuffer（500mL）配方Tris（MW121.1）10mM0.605g蔗糖（MW342）250mM42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW60.06)7M4.2g硫脲(MW76.12)2M1.52gCHAPS(MW614.89)4%（W/V）0.4g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。裂解储液配方（组织）：尿素(MW60.06)5M3g硫脲(MW76.12)2M1.52g双向电泳sun2CHAPS(MW614.89)2%0.2gTris（MW121.1）40mM0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。裂解液：裂解液储液100uLIPGbuffer（pH可选）2%2uLPi2uLNucLeasemix（100×）1uLPMSF（100mM：20mg/mL）1mM1uLDTT（0.411g/mL）40mM1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-2500.01%100g95%乙醇4.7%50mlH3PO48.5%85g将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。二、实验准备：1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）；2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃；3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样双向电泳sun3品。三、样品制备：（一）细胞细胞裂解准备：1、收集细胞，使用大于500g转速离心5min；2、弃去上清，使用washingbuffer重悬细胞沉淀，震摇待细胞完全打散后，继续用大于500g转速离心5min；3、重复步骤2两次，并使用转速2000rpm离心5min，弃上清。细胞可置于-80冰箱保存数周，或使用裂解液裂解。细胞裂解：1、配置裂解液：注意先不要加入DTT。临用前加入PMSF后，立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。2、加入裂解液的细胞置于冰盒内，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中，保证细胞裂解时的温度为4℃。3、裂解15-20min后加入DTT。4、裂解完成后，置于4℃离心机中，以最大转速13200rpm离心30min，取上清，弃沉淀。上清所含提取的蛋白。5、使用bradford法测定提取蛋白浓度。（二）、组织：组织裂解准备：1、提取动物组织。提取时务必保证组织的纯度，尽量减少组织双向电泳sun4混杂，尤其注意血液的混入。2、使用washingbuffer冲洗组织2-3遍，洗净组织的血液、体液、和其他影响实验结果的残留成分。3、准备研钵，洗净并且烘干，准备适量的组织裂解液，准备充足的液氮，石英砂适量。组织裂解：1、配置裂解液：注意先不要加入DTT、PMSF。2、将适量石英砂加入到研钵中，加入液氮冷却。3、将组织放入装有液氮的研钵中，研磨组织，在研磨过程中保证样品在低温状态下。4、研磨完成后将样品及石英砂收集到离心管中，在裂解液中迅速加入PMSF，混匀后将裂解液加入含有样品的离心管中。保持4℃，震荡混匀，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中。5、裂解15-20min后加入DTT。6、使用2000g离心10min，吸取上清即为所提取的蛋白，下层石英砂及组织碎片则丢弃。将上清使用13200g转速离心，弃去沉淀。（三）、血清：血清样品可直接用于双向电泳实验。但样品中含有大量的IgG和白蛋白，需要使用试剂盒去除。四、试剂说明：双向电泳sun5裂解液成分：溶液中还原剂的含量不要超过20mM。尿素/硫脲：变性剂，中性促溶剂，促进样品溶解，破坏氢键等次级结构，使所有离子基团暴露在溶液里。硫脲可以促进膜蛋白的溶解。尿素在30℃以上容易降解，降解产物异氰酸盐可使样本中蛋白质甲氨酰化，对蛋白质进行修饰，造成等电点改变，形成人为地“斑点串”。CHAPS:两性表面活性剂，CHAPS是一种非变性的zwitterionic去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。CHAPS是两性离子去垢剂，分子结构中具有一个胆酸和硫代甜菜碱。在紫外区的低吸光性成为用紫外方法检测膜蛋白的首选去垢剂，CMC值均为8mM。常用于于双向电泳等实验。原理：CHAPS保护蛋白质的天然状态，可溶解膜蛋白，从而互作用。透析可除去。SDS：(FW288.38)离子型去垢剂，裂解力强，基本可以把细胞完全破坏掉。并且使蛋白变性失活。不得与强氧化剂混合。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。NP-40：乙基苯基聚乙二醇（NonidetP40；）很温和的非离子型去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。双向电泳sun6TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子型表面活性剂，能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的TritonX-100常用于漂洗组织标本，0.3%的TritonX-100则常用于稀释血清，配制BSA等。能力介于NP-40和SDS之间，偏向于NP-40，在保护蛋白活性方面有一定作用。EDTA：变性剂和稳定剂，通过螯合金属离子有效抑制蛋白酶的活性。DTT：二硫苏糖醇，还原剂，储液配置：0.4g/mL。使用浓度约为40mM。防止蛋白通过巯基氧化聚合，增加蛋白的可溶性。DTE：二硫赤酰糖醇，与DTT近似，也做还原剂。ASB14:Amidosulfobetaine14，TBP:tri-Butyl-Phosphate磷酸三丁酯、三丁基膦，有毒，具有较低的表面张力，难溶于水，常用作消泡剂。非巯基还原剂，使用浓度为2mM，但溶解性有限，在溶液中不稳定，在样品制备时需DTT联合使用。脱氧胆酸钠：Sodiumdeoxycholate，中度变性剂和蛋白溶解剂。SB3-10：硫代甜菜碱10，诱食剂，甲基供给剂。DeStreak试剂和DeStreak水化溶液：将蛋白质巯基转变为稳定地二硫化物基团，防止发生非特异性氧化反应，有效减少蛋白质在电泳过程中因再氧化而发生的拖尾，特别是pH7-11的范围内（碱性蛋白质）。PMSF：苯甲基磺酰氟，储液配置(100mM)：20mg/mL，在水中易失活，使用异丙醇或DMSO配置。强大的不可逆蛋白酶抑制剂，抑双向电泳sun7制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶以及含有巯基的蛋白酶，使用浓度为1mM。浓度测定：核酸酶（Nucleasemix）：核酸酶的构成是由牛胰腺Dnase和Rnase以及维持最佳核酸酶活性所必须的各种辅助因子组成。核酸酶受EDTA的干扰，使用核酸酶时避免加入EDTA。可与蛋白酶抑制剂（PI）同时使用，但要注意必须选择无EDTA的蛋白酶抑制剂。（注意：核酸酶试剂组为悬浮液，使用前务必震荡混匀后分装。）考马斯亮蓝：Coomassiebrilliantblue.考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590―610nm。测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。灵敏度比Lowry法还高4倍，染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000双向电泳sun8μg／mL。该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。R250较敏感，做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。此方法优点：干扰物质少，K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计双向电泳sun9算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。双向电泳sun10蛋白质纯化一、目的：蛋白质纯化的目的在于去除样品蛋白中的盐、糖以及一些大分子杂质，杂质的存在严重影响双向电泳的结果。二、方法：本实验室蛋白质常用的除杂方法主要有丙酮沉淀、TCA-丙酮沉淀、2D-cLeanup-kit处理。丙酮沉淀：加入3-4倍体积的-20℃保存的丙酮沉淀大于1小时。沉淀结束后使用13200rpm转速离心10min，去上清，将ep管置于冰上晾干5min，后用水化液溶解。TCA-丙酮沉淀：使用含有10%TCA的丙酮溶液（100mL丙酮加入10gTCA（三氯乙酸），也可加入0.07%的DTT）,沉淀方法与丙酮沉淀类似。最后离心获得的沉淀较丙酮沉淀难溶，可使用丙酮冲洗沉淀样品，以除去残余的室温放置5min，待样品蛋白中的丙酮挥发完毕，使用水化液溶解沉淀。TCA沉淀：使用100%TCA溶液（500gTCA加入227g水）吸取11.1ul加入到100ul的样品中，沉淀过夜。之后离心取沉淀，务必使用丙酮清洗沉淀数次，待样品稍微变干时使用水化液溶解蛋白。2D-cLean-upkit：去除TritonX-100和SDS等形成双向电泳中低浓度高分子量微团，有效去除去垢剂、盐分、脂类、核酸等干扰成分。实验方法可按照试剂盒的说明。透析：可有效去除样品中的盐分及干扰离子。所用的透析溶液应至少40倍于样品量，将样品置于透析管中，透析管置于搅拌器双向电泳sun11上的透析溶液中，搅拌器的速度应调小，避免过快转速导致透析膜破裂。透析时间大于2小时。透析温度若要避免蛋白质降解或修饰，则应在4-8℃；如果不担心蛋白质降解或修饰，透析温度可适当调高，透析速度则会加快。透析溶液应当与样品液相同，如果是裂解液，则透析溶液中至少尿素、硫脲、DTT浓度应与裂解液相同。但必须考虑CHAPS、IPGbuffer的损失。三、试剂说明：TCA与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用：1、在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐；2、作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏