饵料生物培养技术实验讲义

饵料生物培养技术实验讲义上海水产大学渔业学院饵料生物实验室二零零三年六月目录1、常用单细胞藻类的形态观察-------------------------------------12、饵料微生物个体及筛网孔径大小的测定----------------------23、单细胞藻类浓度的测定-------------------------------------------44、单细胞藻类的分离（一）微吸管分离法----------------------65、单细胞藻类的分离（二）平板分离纯化技术----------------86、单细胞藻类的培养（中继培养）------------------------------107、轮虫的培养------------------------------------------------------------128、卤虫卵的去壳---------------------------------------------------------139、卤虫卵的孵化率测定------------------------------------------------1510、单细胞藻类叶绿素含量的测定-----------------------------------17实验一常用单细胞藻类的形态观察一、实验目的：观察并识别作为饵料生物的代表性单细胞藻类的种类，为后继单细胞藻类的分离和培养做准备。二、实验器材1、藻种绿藻门：Chlorophyta小球藻chlorellasp.盐藻Dunaliellasp.青岛大扁藻Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis亚心形扁藻Plytamonassubcodiformis硅藻门：Bacillariophyta三角褐指藻Phaeodactyluntricornutum小新月菱形藻Nitzschiaclosteriumf.minutissima中肋骨条藻Skeletonemacostatum牟氏角毛藻Chaetocerosmuelleri金藻门：Chrysophyta巴夫藻Pavlovaviridis微绿球藻Nannochloropsisoculata球等鞭金藻Isochrysisgalbana湛江等鞭金藻Isochrysiszhanjiangensis蓝藻门：Cyanophyta钝顶螺旋藻Spirulinaplatensis黄藻门：Xanthophyta异胶藻Heterogloeasp.2、实验器材光学显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，鲁哥氏碘液，甲醛溶液，滴瓶，无菌水，擦镜纸，吸水纸三、操作步骤及要求1、用胶头滴管吸取液体培养的各种藻类样品，滴到载玻片上（若藻种浓度大用无菌水稀释），用显微镜（低倍和高倍）观察细胞的形态大小，色素分布，运动方式，然后用碘液或甲醛固定样品，观察细胞的鞭毛着生情况（长度、数量），细胞的内部结构等。2、描绘5种藻类形态、构造图，描述各种藻类的特征颜色。运动性的藻类，描述其细胞游动方式。实验二饵料生物个体及筛网孔径大小的测量一、实验目的1、学会并掌握使用目测微尺和台测微尺在显微镜下测量物体大小。2、对各种生物饵料和筛网孔径大小有直观认识。二、实验器材1、器材光学显微镜，目测微尺，台测微尺，载玻片，盖玻片，胶头滴管，鲁哥氏碘液，擦镜纸，水，吸水纸2、样品各种规格的筛网小片，扁藻，三角褐指藻，小球藻，卤虫休眠卵，褶皱臂尾轮虫三、方法与步骤（一）、目测微尺的校正目测微尺也称目微尺，为一圆形光学玻璃片，可被安装到光学显微镜的目镜中。玻片中央刻有一条线段，此线段被等分成共100格。由于显微镜物镜下的物体经过放大，而目镜中的目测微尺没有被放大，因此，当以目测微尺为参照物，目测微尺的每一格刻度线的测量长度因显微镜物镜的放大倍数的不同而不同。故必须用台测微尺进行校正，以求得在特定的放大倍数下，目测微尺每一格线所代表的真实长度。台测微尺也称台微尺，是一片中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般为1mm等份成100格，每一格的实际长度为1/100mm，即10.0微米。当要校正目测微尺时，先将显微镜的目镜取下，旋开目镜，将目测微尺装入目镜镜筒内的搁板上，然后旋紧目镜。注意，目测微尺的有刻度面应朝上。将带有目测微尺的目镜重新装好，此时观察目镜可见视野中央有一刻度尺。确认目测微尺的刻度线清晰，明了。若刻度线不清楚，则需将目测微尺重新取出，用擦镜纸小心擦拭后重新安装。将台测微尺置于显微镜的载物台上，先用低倍镜观察，调节调焦旋钮和光栅，直至看清楚台测微尺的刻度线。旋转目镜，使目测微尺与台测微尺平行。移动载物台的推进器，先使两尺重叠，再使两尺在视野的左方某一刻度完全重合。然后从左到右寻找第二个完全重合的刻度。并计数两重合线段之间目测微尺和台测微尺的格数。由于台测微尺的刻度是镜台上的实际长度（10微米），故可通过下列公式计算出当前放大倍数下目测微尺每格的测量长度：目测微尺每格长度（微米）=两重叠刻度之间台测微尺的格数*10/两重叠刻度之间目测微尺的格数同样，将物镜转换成高倍物镜，再次校正在高倍镜下目测微尺每格的测量长度。校正完毕，将台测微尺擦拭干净后小心放好。（二）测量：取一干净的载片。用吸管吸一滴微藻样品。小心地加好盖片后在显微镜下观察。调好焦距。转动目微尺测出其长、宽各等于目微尺多少格。再由已经计算出的相应的放大倍数下目微尺每格的长度（u）。算出饵料个体的长，宽的实际长度。将轮虫用鲁哥氏碘液固定后，在低倍镜下测量轮虫兜甲的长宽。其他饵料样品依次同样进行测量。在测定筛网孔径大小时，先在载玻片上滴加一滴水，将一小片筛网放在水滴上，然后在其上加盖盖玻片，测量其孔径（内径）的长宽。四、实验报告：1.写明你所用的显微镜号码，高，低倍镜的放大倍数及在高、低倍镜下目测微尺每格长度的计算。2.量出4种生物饵料样品的长，宽，每种测量3个细胞。3.测量200目、120目、100目和80目四种筛网的孔径大小。实验三单细胞藻类浓度的测定一，实验目的：1、熟悉饵料微生物的定量方法。2、掌握血球计数板的使用，学会正确定量饵料微生物的浓度。二，血球计数板的原理和构造血球计数板由一块特殊规格的载玻片特制而成。板的中央透明区一般由一H形沟分成两块。每一块即是一计数池。每个计数池上分别刻有准确面积的大、中、小方格。一般每个计数池被分成九个大方格。每个大方格的面积为1平方毫米。计数池两侧的凸起部分与计数池之间有1毫米的高程差。因此，当在计数池上方加盖盖玻片时，盖玻片下每个大方格区域内的体积为1立方毫米。计数池中央的大格又被双线划分成25个中格，其中的每个中格又被单线划分成16个小格（也有一类计数板的每一个中央大格先分成16个中格，每个中格分成25个小格）。因此，在中央大格内，1平方毫米被均匀分成16*25（即400）等份。计数时，当样品用细口滴管滴加到计数池后，通常计数中央大格的五个中格内的细胞数，即可推算出整个中央大格内的细胞数，即1立方毫米的细胞数。由此可推算每毫升内饵料生物的浓度。三、实验器材：1、器材光学显微镜，血球计数板，盖玻片，计数器，5毫升量筒，1毫升移液管，细口胶头吸管，擦镜纸，吸水纸，消毒海水，鲁哥氏碘液，纱布。2、样品小球藻，湛江等鞭金藻四、方法与步骤：1、将盖玻片和计数板用擦镜纸擦拭干净，将盖有盖玻片的计数板放在显微镜的载物台上，调焦，用低倍镜仔细观察计数池的结构。2、将计数板连同盖玻片一起取下，用细口胶头滴管吸取摇匀的藻液，迅速将吸管尖靠在计数池上盖玻片的边缘，略挤胶头滴管使藻液进入盖玻片下，直至充满整个空间，多余的藻液会流入H形的凹沟中。注意，当藻液浓度高时，为了便于计数，可将藻液稀释后进行计数。在计数有鞭毛或有运动性的藻类时，可先吸取定量的藻液，滴加鲁哥氏碘液进行固定，然后添加消毒海水稀释后计数。3、样品添加到计数池后，静置片刻。在显微镜下仔细调焦，同时调节光栅，必要时调节光源和反光镜角度，直至细胞和纵横格线都清楚。4、统计计数池中央大方格内四角及中央中格内的饵料生物的数量。并记录。计数时，小心移动载物台，从上到下，由左及右又由右及左依次计数各小格内的细胞数。凡压方格的上线和左线的细胞，统一算此方格内的细胞，而压方格的下线和右线的细胞，统一不算此方格内的细胞。5、将计数板及盖玻片用流水冲洗，擦干，重复上述步骤，对同一样品再技术2-3次。6、将同一样品的计数结果，取平均值。代如下式，求算单胞藻的密度：单胞藻密度（个/ml）=平均每小格内的细胞数*16*25*10000*稀释倍数7、计数完毕，将血球计数板冲洗干净，用纱布吸干水分，用擦镜纸包装后连同盖玻片一起放入原盒子内。五、报告与数据处理将原始记录连同计数结果，填写实验报告。实验四单细胞藻类的分离（一）微吸管分离法一．实验目的：藻类在自然界中与其他生物杂居在一起，在研究工作中。常常需要把它们和其他生物，特别是其他藻类分开，进行单种或纯种培养，这叫分离。本实验的目的是使学生熟悉单细胞藻类的微吸管法分离技术。二．实验器材：解剖镜，显微镜，凹玻片，载玻片，大盖片，喷灯，砂轮，细玻管，橡皮头，培养皿，无菌培养液，待分离藻种。三、方法与步骤：1、拉制微吸管：用砂轮将孔径3—4mm玻璃管载成35—40mm的段。浸入浓HCL（或HNO3）溶液中洗去污物。先用自来水，后用蒸馏水洗净烘干。然后点燃喷灯，两臂加紧，手持玻璃管在火焰上烧灼其中部一面烧一面转一面。使其受热均匀。待玻璃管烧红软化后稍向上提，两手均匀用力。向相反方向拉引。将中段拉长约6—10cm。使这段孔径约为0.5mm。冷却后从中间拉断。尾部在喷灯上烧红迅速压在玻璃板或石棉网上，使成扩张状。使用前将吸管在酒精灯上加热，用镊子夹住细头部拉成孔径约0.1mm的微吸管，尾部套上橡皮头或孔胶管备用，如进行纯种（无菌）培养，微吸管需经灭菌。为了防止擦伤藻体，微吸管头部可在酒精灯上烧灼圆滑。2、分离：首先镜检待分离藻液，如浓度过大应予以稀释，一般以每小滴藻液中含5—10个藻细胞为宜。13579●●●●●●●●●2468在一已灭菌后的清洁载片上滴加9滴消毒培养液，方法如上图。另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻液，在解剖镜（或显微镜）下用微吸管吸取其中所需的藻体（最好是1个，也可以是多个2—5个）放入第一滴水中，用一干燥的吸管洗（从一边吹水滴，使藻体在水中旋转，均匀）。然后换一干净的微吸管从第一滴水中吸一个（或数个）藻细胞，放入第二滴水中，清洗，依次而下，直至水滴中含一个藻细胞。（清洗是为了洗去藻体上附有的细菌，进行无菌培养）。用微吸管将此单个藻细胞转移到滴有培养液的盖玻片上，将盖玻片在凹玻面上进行悬滴培养。每天数次观察藻体分裂情况。如繁殖良好，可以扩大培养成纯（单）种。扩大后的培养液镜检为单种时，分离成功。注意：1、培养液配方根据待分离藻种的不同选择，一般用F/2配方。2、此微吸管所形成的小滴以显微镜低倍镜一个视野能全看到为宜。但又不能太小，以免很快干掉。四、报告与讨论1、在分离中需要注意哪些问题？2、怎样才能熟练掌握分离技术？实验五单细胞藻的分离（二）平板分离纯化技术一、实验目的：本实验的目的是使学生熟悉并掌握利用平板分离单细胞藻类的技术。二、分离原理：用平板分离纯化藻种，一般可分为划线，喷雾和倾注平板等方法。其共同点是分离用水样首先经过适当稀释，再使水样分散到固体平板培养基上。等藻类在平板上成藻团时进一步分离，直至成单种。三、实验器材：中试管，大试管，培养皿，移液管，烧杯，分装漏斗，血球计数板，计数器，接种针，喷雾器，营养盐成分，待分离单胞藻等。四、方法和步骤：1、培养基的制备配方如下：1000ml培养基中的加入量100ml培养基中的加入量N—4（F/2）N1ml（相当于4mlF/2N）8滴*(F/2N)P—4（F/2）P1ml相当于4mlF/2F）8滴EDTA-Na21ml（4*36.3um储液）2滴柠檬酸铁0.5ml(1%储液)1滴Soilextract（浓)1ml2滴Agar12g1.2gSeaWater1000ml100ml*