基因工程第三章基因工程的载体

Chapter3GeneCloningVector载体（Vector）基因克隆载体(genecloningvector):能承载外源基因，将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。载体的功能（FunctionofVector）运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)ori复制起始点(ReplicationOrigin,ORI)遗传标记(Geneticselectionmark)pUCMCSAmpr克隆载体的结构特征(CharacterofVector)(1)针对受体细胞的可转移性；(2)自主复制功能；(3)显著的筛选标记；(4)特定的多克隆位点；(5)安全性；克隆载体具备的条件：载体分类：1）根据构建克隆载体所用的DNA来源分为：质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体等。2）根据应用对象分：原核生物克隆载体植物克隆载体动物克隆载体3）按照功能分：克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中1质粒克隆载体2病毒（噬菌体）克隆载体3染色体定位整合克隆载体4人工染色体克隆载体5特殊用途克隆载体1质粒克隆载体1.1与构建克隆载体相关的质粒性质1.2质粒载体必须具备的基本条件1.3质粒克隆载体的构建质粒载体以质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，含有质粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。1.1.1质粒组成与构型1.1.2质粒DNA大小1.1.3质粒DNA的复制1.1.4质粒的不亲和型1.1.5质粒迁移1.1.6显性质粒和隐蔽质粒1.1与构建克隆载体相关的质粒性质1.1.1质粒组成与构型质粒(plasmid)是一种寓于宿主细胞中染色体外的裸露DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。数量：每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数，少者几个，多者上百个。存在广泛：许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒。DNA构型：在宿主细胞内，质粒一般以ccc-DNA的形式存在。体外在理化因子作用下，质粒可能成为开环DNA和线形DNA分子。1.1.2质粒DNA大小质粒DNA分子小的不足2kb，大的可达100kb以上，多数在10kb左右。1.1.3质粒DNA的复制质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自我复制。COP因子：决定质粒的拷贝数，指挥细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻遏物的量也积累到足以阻止质粒的复制。Rep基因：指挥宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制。Par基因：保证细胞分裂时质粒正确分配到子细胞。“严紧型”质粒（StringentPlasmid）：低拷贝数，每个宿主细胞仅含1-3份的拷贝。“松弛型”质粒（RelaxedPlasmid）：高拷贝数的，每个宿主细胞可达到10-60份拷贝。1.1.4质粒的不亲和性（plasmidincompatibility）质粒的不亲和性，也称不相容性:在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。1.1.5质粒迁移(PlasmidMobilization)通过接合作用,质粒可以转移到新的宿主细胞中。Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，实现遗传物质的转移。分为两种：接合型质粒(ConjugativePlasmid)：含有自我复制基因、接合转移Tra基因，拷贝数少，分子大。非接合型质粒(non-ConjugativePlasmid)：能够自我复制，但不含Tra基因，这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞；较安全，且拷贝数多，分子小，适于构建克隆载体。1.1.6显性质粒和隐蔽质粒显性质粒：也称表达型质粒，质粒携带一些除与自身复制和转移相关的基因外，还有别的基因使得宿主细胞出现新性状。隐蔽质粒：宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表现。显性质粒的相关基因：抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr，产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）。降解基因：降解重金属、有机物和农药等。致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒。1质粒克隆载体1.1与构建克隆载体相关的质粒性质1.2质粒载体必须具备的基本条件1.3质粒克隆载体的构建(1)能自主复制，即本身是复制子(2)具有多种限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；(3)在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。(4)分子量要小，多拷贝，易于操作。；(5)构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件（小DNA片段）。1.2质粒载体必须具备的基本条件天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记复制类型pSC1015.8×1069.09kb1~3EcoRItetr严紧ColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适如何识别载体上的各种元件及其功能：1.3.1大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构1.3.3农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5酵母2um质粒克隆载体1.3质粒克隆载体的构建（1）pBR322：p-plsmid，BR分别为该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母，“322”为实验编号。含有双抗基因（Apr，Tcr）和ColE1复制起始子。优点：①具有较小的分子量，4363bp。②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。含有24种单一的限制性内切酶识别位点，且BamHI、SalI和PstI等几个酶切位点分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因上，当将外源DNA片段插入到这些位点时，可用抗生素基因的失活来筛选重组体。③具较高的拷贝数，经过扩增之后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝。pBR322质粒载体的筛选插入失活筛选法(2)衍生pUC质粒载体由美国加利福尼亚大学（UniversityofCalifornia）J.Messing和J.Vieria于1987年构建。包括如下四个组成部分：i)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；ii)氨苄青霉素抗性基因(ampr)；iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ'基因；iiii)位于lacZ'基因中的靠近5’--端的一段多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）区段。pUC18-19多克隆位点表达性载体（ExpressionVector）：根据宿主细胞的不同，表达蛋白质的载体大致可分为：原核生物表达载体和真核生物表达载体。由于真核生物种类繁多，又分为酵母表达载体，植物表达载体，昆虫类表达载体和哺乳类表达载体等等。原核生物表达性载体（ProkaryoticExpressionVector）：pGEXVector(GSTtagExpressoinVector):pGEXVectorMCSregion：pETVector(StagExpressoinVector):pETVectorMCSregion：真核核生物表达性载体（EukaryoticExpressionVector）：pcDNA3.1mammalianExpressionVector:pcDNA3.1VectorMCSregion：pEGFP-C1mammalianExpressionVector:GFPandREPExpressionVector:pMSCpuroRetroviralVectorMap:RetroviralVector:1.3.1大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建1.3.3农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5酵母2um质粒克隆载体1.3质粒克隆载体的构建（ConstructionofPlasmidVector）:致癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)含一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，这种质粒会引发植物在创伤部位组织增生而形成植物肿瘤(冠瘿瘤)，称此质粒为Ti质粒(tumorinducingplasmid)。1.3.3农杆菌Ti质粒载体的构建上：电镜下的根癌农杆菌下：冠瘿瘤Ti质粒是双链环状DNA分子，约200kb，分四个区：1）T-DNA(transferDNA)：25kb，进入植物细胞区域含有多种基因，其表达产物破坏植物细胞内源激素的平衡，干扰细胞分裂从而引发植物肿瘤。T-DNA左右两边界(LB，RB)各有一个25bp长的正向重复序列(LTS和RTS)，对T-DNA的转移和整合是不可缺少的。2）Vir区：位于T-DNA上游的一组基因，表达产物能激活T-DNA向植物细胞转移，引发植物肿瘤，显示细菌的致病性。3)Con区：含有tra基因，农杆菌之间转移接合4)Oir区：调控质粒的自主复制与大肠杆菌的质粒载体不同，构建的Ti质粒载体不真正用于细菌，而是用于植物细胞，农杆菌只起着中间介导的作用。构建共整合质粒载体和双元载体LBRBT-DNA外源基因植物细胞筛选标记Kmr大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记农杆菌ori大肠杆菌ori将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；双元整合载体1.3.1大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建1.3.3农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5酵母2um质粒克隆载体1.3质粒克隆载体的构建（ConstructionofPlasmidVector）1.3.5酵母2μm质粒载体酵母是一种最简单的单细胞异养真核生物，可以像细菌一样进行基因操作，能够在廉价的培养基上生长，可高密度发酵。酵母又具有真核生物的特性，具有对外源基因翻译后进行蛋白质加工和修饰的功能。几乎所有的酿酒酵母菌中都存在2μm质粒。利用2μm质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建酵母质粒载体，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，又称为穿梭载体。YEP载体（游离型）质粒克隆载体的用途用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。构建基因组文库和cDNA文库。可用于目的基因的测序。作为核酸杂交时探针的来源。回顾plasmid质粒载体必须具备的基本条件pUC18/19质粒载体pBR322质粒载体Ti质粒pUC18/19质粒载体的组成特点、结构图。插入失活α-互补T-DNA1质粒克隆载体2病毒（噬菌体）克隆载体3染色体定位整合克隆载体4人工染色体克隆载体5特殊用途克隆载体病毒由DNA(或RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制和壳蛋白的合成，实现病毒颗粒的增殖。2病毒（噬菌体）克隆载体λ噬菌体克隆载体M13克隆载体Cosmid克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体2.1.1λ噬菌体性质•λ噬菌体由DNA和外壳蛋白组成，分为头部和尾部。2.1λ噬菌体克隆载体（1）λDNA：λDNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。COS位点(cohesiveendsite):左右两端各有12个核苷酸组成的5’凸出黏性末端，而且两者的核苷酸序列互补。（2）λ基因组DNA的结构含50个以上的基因，各司其职。AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIII