基因工程-第一章-核酸的制备

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Chapter1Preparationofnucleicacid核酸:遗传信息的储存物质脱氧核糖核酸:deoxyribonucleicacid,DNA核糖核酸:ribonucleicacid,RNA区别:第一节天然DNA的制备(PreparationofDNA)一、DNA的组成与结构(CompositionandStructureofDNA):Aphosphategrouplinkedbyaphosphodiesterbondtoapentose(afive-carbonsugarmolecule)thatinturnislinkedtoanitrogen-andcarbon-containingringstructurecommonlyreferredtoasa“base”.BasePentosePhosphateGroupNucleotide主要碱基的化学结构:结构:DNADNA解链温度(Tm,meltingpoint)DNA分子杂交(HybridizationofDNAstrandsfromdifferentsources)环状DNA(CircularDNA)超螺旋DNA(supercoiledDNA,SC-DNA);共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA);开环DNA(opencircleDNA,oc-DNA);线形DNA(linearDNA,L-DNA)二、天然DNA的提取(PurificationofDNA)(一)生物材料的准备(PreparationofMaterial):1.DNA的保存:1.1.70%的乙醇(Ethanol)1.2.TE溶液(Tris-Cl10mmol/LpH8.0,EDTA1mmol/L)1.3.低温2.大肠杆菌(E.coli)常见抗生素(Antibiotics)的使用:2.1氨苄青霉素(ampicillin,Ap):抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成,50~150μg/mL(水溶液);2.2链霉素(streptomycin,Sm):与细菌核糖体30S亚单位结合,抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡,25~50μg/mL(水溶液);2.3四环素(tetracycline,Tc):与细菌核蛋白体的30S亚单位结合,干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用,从而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合,5mg/mL(乙醇溶液);2.4氯霉素(chloramphenicol,Cm):与细菌核蛋白体50S亚基结合,抑制肽酰基转移酶,从而抑制蛋白质合成,20μg/mL(乙醇溶液);2.5卡那霉素(knamycin,Km):与细菌核蛋白体蛋白基结合,并与较小的RNA亚基编译区的特定碱基结合,从而抑制蛋白质合成,25~50μg/mL(水溶液);(二)裂解细胞(Celllysis):1.化学方法:1.1CTAB裂解法:CTAB(cetyltriethyammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),阳离子去污剂,与核酸形成复合物,在高盐溶液(>0.7mol/LNaCl)中稳定,在低盐溶液(≤0.3mol/LNaCl)中沉淀。1.2SDS裂解法:SDS(sodiumdodecylsulfate,十二烷基磺酸钠),阴离子去垢剂,蛋白质变性剂,有效沉淀多糖,与K离子形成絮状沉淀,广泛用于质粒(plasmid)DNA的提取,蛋白质的分离纯化。2.酶裂解方法:2.2蛋白酶K(ProteinaseK)裂解法:用于水解蛋白质,特别是与DNA结合紧密的组蛋白(Histone),广泛用于动物组织基因组DNA的提取,通常与SDS,Tris-Cl及EDTA共同裂解细胞。2.3溶菌酶(lysozyme)裂解法:通常用于细菌裂解,提取质粒DNA,其原理是破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架,通过低渗透压使细胞胀裂,引起细胞裂解。作用条件温和,pH6.0~7.0,室温25℃。(三)DNA的分离和抽提1.酚-氯仿抽提法:苯酚(phenol)-氯仿(chloroform)-异戊醇(isoamylalcohol)比例:25:24:1,苯酚:蛋白质变性剂;氯仿:蛋白质变性剂;并使变性的蛋白质从水相层分离;异戊醇:防止产生泡沫。2.氯化铯密度梯度离心法(CsCldensitygradientcentrifugation);3.固相萃取法(solidphaseextraction,SPE);离心技术在基因工程中的应用(ApplicationofCentrifugationtechniques)(四)DNA的纯化(purification)和浓缩(condense)1.DNA的纯化:1.1Rnase处理,去除RNA;1.2离子交换层析法;1.3氯化铯密度梯度离心法;1.4琼脂糖电泳洗脱法;琼脂糖电泳(Agarosegelelectrophoresis)1.安放好制胶模具(梳子和胶槽)2.琼脂糖凝胶浇灌并冷凝3.移走梳子,暴露出上样孔4.琼脂糖胶放置在电泳缓冲液中5.上样,通电流,直至DNA迁移到适当位置6.在紫外光(UV)下观察DNA电泳情况DNA电泳完毕后的琼脂糖凝胶在紫外光(UV)下观察DNA电泳情况不同凝胶的DNA电泳情况琼脂糖凝胶(agarose)聚丙烯酰胺凝胶凝胶(PAGE)电泳仪(电源和电泳槽)离子交换柱层析纯化DNA2.DNA的浓缩:2.1乙醇(Ethanol)沉淀法;2.2正丁醇(butylalcohol)抽提法;2.3聚乙二醇(PEG6000)浓缩法;第三节人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成PCR反应(PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应):模仿细胞内发生的DNA复制过程,在体外有酶催化合成特异性DNA片段。PCR技术简史1971年,Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,所以,Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR)基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖1.PCR的基本原理(MechanismofPCR)类似于DNA的体内复制。其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以几何级数倍增。5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555Cycle3555555555555555525~30次循环后,模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。(3)PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR反应标准的PCR反应条件:10X缓冲液(Buffer)10μL4种dNTP混合物各200umol/L引物(Primer)各10~100pmol模板DNA(Template)0.1~2μgTaqDNA聚合酶0.5~2.5UMg2+1.5mmol/LPCR反应70-75℃90-94℃37-60℃PCR循环1234522557294时间(min)温度(℃)PCR反应适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍37-60℃90-95℃70-75℃PCR扩增No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget12243841653266420220=1,048,57630230=1.07X1071cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR反应特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液,2~4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA(1)TaqDNA聚合酶(2)PwoDNA聚合酶(3)TthDNA聚合酶(4)C.therm聚合酶4.2.1耐热性DNA聚合酶(1)TaqDNA聚合酶1986年从一种75℃热泉中的细菌(Thermusaquaricus)中分离纯化出来的。95kDa,单分子酶,75℃活性最强。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,无3’-5’外切活性。95℃时半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很强,聚合速度快,在72℃的聚合速度为每秒30-100碱基。由于没有3'-5'外切活性,在扩增过程中有8.9-11x10-5的错配率。(2)PwoDNA聚合酶来自古细菌Pyrococcuswoesei,由德国宝灵曼公司开发(BM),90kDa,100℃的半衰期大于2小时,具有3’-5’外切活性,出错率低,使用较多的的且具有高保真度的PCR酶。(3)TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌(Thermusthermophilus),由Promega公司开发成商品。94kDa,95℃的半衰期为20分钟。在Mg2+存在条件下以DNA为模板合成DNA,而在Mn2+存在下可以RNA为模板合成cDNA。因此可在高温下做RT-PCR(反转录PCR)反应,避免RNA反转录过程中形成的二级结构。(4)C.therm聚合酶来自Carboxydothermushudrogenoformans,以Mg2+为辅助因子的逆转录酶,最适温度适60-70℃,同时也具有3’-5’外切酶校对活性,用于RT-PCR反应。4.2.2靶DNA/模板单、双链DNA均可。纯度:不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。使用浓度:一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。其两端20-30bp序列用以一对引物的设计。①引物长度18~30bp,过短则降低特异性,过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增,同时也增加引物合成的成本。②避免引物内部或引物之间存在互补序列(3个碱基),避免序列内有较长的回文结构,减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。③G/C和A/T碱基均匀分布,G+C含量在40~60%之间,引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布,避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。4.2.3PCR引物④引物3’末端碱基应与模板DNA严格配对,并且3’末端为G、C时引发效率较高。⑤引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配,可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等),便于克隆和表达。⑥引物用核酸序列保守区内设计并具有特异性,引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。4.2.4PCR原材料dNTP脱氧核苷三磷酸四种dNTP浓度应相等要求:浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量4.2.5PCR缓冲液成分:10mmol/LTris-HCl(pH8.8室温下),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2。Mg2+:是DNA聚合酶的激活剂,0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过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