PCR扩增和电泳检测ppt课件

实验13DNA片段的PCR扩增1、用PCR技术对DNA进行扩增2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测1电泳观察PCR反应实验步骤2DNA在体内复制的条件是什么？模板：酶：原料、能量：解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每条链dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物：温和的反应条件3DNA分子的结构4合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸5合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP6聚合反应机理：5'3'OPGOPA模板链CTA3'5'引物3'3'5'5'OHOPGOPAOOHTP模板链CTA3'5'引物3'3'3'5'5'5'POOHTPP3'5'7DNA聚合酶8不同细胞的细胞周期不同生物细胞需要的时间细菌一般是20~30分钟蚕豆根尖细胞17.3小时小鼠十二指肠细胞15.3小时人的肝细胞22小时人的宫颈癌细胞22.5小时PCR技术可在几小时内，将特定核酸序列扩增百万倍!9PCR的概念PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。10PCR的反应体系DNA模板原料：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物：（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶11PCR技术原理变性退火延伸12PCR三步曲预变性保温变性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃13PCR仪14用于PCR的预混液（500L体系）：ddH2O310L10×butter50LMgCl240LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25LTaqDNA聚合酶5L标记一个微量离心管，用取样器取20L的预混液加入到该管中。15反应试剂用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ（浓度10μM）1μL引物Ⅱ（浓度10μM）1μL模板DNA5μLddH2O3μL总体积20μL16微量可调移液器（一档吸、二档排）17•PCR反应参数：变性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s预变性94℃300s保温72℃600s循环次数35181、基本概念以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳19琼脂糖凝胶电泳基本原理2021制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。琼脂糖凝胶电泳的过程22将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。制胶23将梳子从制胶槽中拔出24取出凝胶板放入电泳槽中向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶25琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1、增加电导率；2、维持电泳过程中的合适的pH。26吸取PCR反应产物10µL。注意吸头要插入到管底，才能取到PCR产物。将PCR产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次）混样27常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。溴酚蓝增加样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内。核酸荧光染料可嵌合入DNA分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。（需要与加样缓冲液混合）28加样29进行电泳10-20分钟电泳30•实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后，在DNA图谱观察仪的可见光下发射黄绿色荧光。电泳结果的观察在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。31PCR的应用•PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。32