云南师范大学毕业论文

I成人继续教育学院学生（科）毕业论文（科研初步训练论文）论文题目H2株病毒接种量与收获量的相关性研究学院、专业生命科学学院生物科学年级2010学生姓名岳俊指导教师职称学号107830005二零一四年十月十五日II内容提要：III云南师范大学毕业设计（论文）H2株病毒接种量与收获量的相关性研究年级:2010学号:107830005姓名:岳俊专业:生物科学指导老师:二零一四年十月2摘要本文采用酶联免疫吸附试验[1]（双抗体夹心ELISA）检测在人胚肺二倍体细胞KMB17细胞上（以下简称“KMB17细胞”）以不同MOI接种甲型肝炎病毒H2减毒株后得到的病毒收获液，研究MOI与收获液效价之间的关系。通过对5个试验批收获液的检测数据研究表明：MOI与收获液效价之间没有明确的关系。经分析发现：1.H2株接种后随着细胞的分裂而不断增殖并释放少量抗原至培养液中继而进入新的细胞继续增殖。2.感染性滴度的检测：一方面毒种需要进行10倍系列稀释至-8，要求精度较高，另一方面酶联免疫吸附试验操作步骤较多容易造成误差。关键词：MOI；感染性滴度；抗原检测；3AbstractInthispaper,usingenzyme-linkedimmunosorbentassay[1](doubleantibodysandwichELISA)detectioninhumanembryolungdiploidcellKMB17cells(hereinafterreferredtoastheKMB17cells)withMOIofdifferentinoculationofhepatitisAvirusH2attenuatedvirusliquidobtainedafterharvest,TostudytherelationshipbetweenMOIandharvestliquidtiter.Throughtheshowonthe5testbatchofharvestedliquiddetectiondataresearch:thereisnoclearrelationshipbetweenMOIandharvestedliquidtiter.Theanalysisfoundthat:1.H2strainafterinoculationwithcelldivisionandproliferationandcontinuetoreleaseasmallamountofantigenintotheliquidculturemediumandthenenterthenewcellscontinuetoproliferate.2.Detectionofinfectioustitersofvirus:handneedstobe10foldserialdilutionto-8,requiringhighprecision,ontheotherhand,enzymelinkedimmunosorbentassaystepsmoreeasytocausetheerror.Keywords:MOI;infectivetiter;antigendetection;4目录本论文的背景和意义....................................................................................................................5本论文的主要方法和研究进展....................................................................................................5KMB17细胞扩增.............................................................................................................................5H2株病毒接种................................................................................................................................5病毒收获........................................................................................................................................6抗原检测........................................................................................................................................6感染性滴度检测............................................................................................................................7酶联免疫吸附试验（双抗体夹心ELISA）...................................................................................8滴度尾数查算表............................................................................................................................8结论........................................................................................................................................9致谢..............................................................................................................................................10参考文献......................................................................................................................................11附录1KMB17细胞株...............................................................................................................12附录2H2株..............................................................................................................................1351本论文的背景和意义现今疫苗已经成为疾病预防的主要手段，降低疫苗的生产成本不仅有利于大规模的推广使用疫苗消灭疾病，还能使疫苗生产企业减少物资的投入，节约资源。在此就中国医学科学院医学生物学研究所（以下简称“生物所”）生产的冻干甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中甲型肝炎病毒H2减毒株（以下简称H2株）接种MOI与病毒收获量的相关性进行初步试验研究。生物所从事多年的冻干甲型肝炎减毒活疫苗的生产，病毒收获阶段的效价检测结果有的批次效价高，有的批次效价低，效价高的批次可以更大倍数稀释病毒原液后进行分装。相同的培养条件下为什么各批次间的效价会有明显差异。本论文通过不同MOI接种病毒，经培养后收获病毒原液。用酶标分析仪检测不同MOI所收获的病毒收获液的效价和感染性滴度，以找到生产出高效价病毒原液的最适MOI。意义：生产高效价病毒原液，减少原材料的耗费和人力物力的投入，大幅降低生产成本。2本论文的主要方法和研究进展2.1KMB17细胞扩增从细胞库领取工作种子在37℃恒温室进行培养，每隔四天按1：2比例进行细胞传代扩增8个细胞工厂。2.2H2株病毒接种领取10代H2株工作毒种经超声破碎后按“表1H2株病毒接种量与检测结果汇总表”所示MOI和五个试验批的细胞悬液进行病毒吸附后分按1:4比例分种,培养温度为35℃。H2株工作毒种抗原含量为107.67/ml，MOI为病毒感染复数MOI=病毒数/细胞数。为了保证批间差异最小化，细胞悬浮液经混合均匀后分成五个批次再下表MOI加入病毒进行吸附。表1H2株病毒接种量与检测结果汇总表Table1H2strainsofthevirusinoculumanddetectionresultssummary批号培养面积细胞总量MOI毒种加量ml抗原检测感染性滴度S16*10*632cm215亿0.288.910247.50S26*10*632cm215亿0.319.910247.34S36*10*632cm215亿0.5016.010248.33S46*10*632cm215亿1.0032.110247.50S56*10*632cm215亿1.5048.110247.5062.3病毒收获从病毒接种之日起9-12天更换细胞维持液，22-26天按四倍浓缩（5ul/cm2）进行病毒收获并做无菌检查。2.4抗原检测各批病毒收获液经超声破碎细胞后取样倍比稀释至如下表“表2抗原检测上样计划表”所示并复孔上样至酶联免疫吸附法检测试剂(盒)[2]，设置阴性对照、标准品参考。使用酶标分析仪[4]检测OD值。检测结果如下表“表3抗原检测OD值”。Cutoff=阴性对照平均值*2.1=0.236，OD值大于0.236的为阳性，小于0.236则为阴性。结果显示不同MOI种毒收获液抗原检测均为1024（效价相同）。表2抗原检测上样计划表Table2antigendetectionsampleschedule表3抗原检测OD值Table3antigendetectionOD123456789101112A3.6733.5493.5063.3483.7223.8263.5083.6023.4613.3520.134B3.2143.1082.8172.6433.5513.4313.2803.1753.3263.2490.107C1.6591.7621.3761.4821.5971.5521.7141.6291.5721.5380.096D0.8370.9150.6980.7540.8390.7090.9260.8910.8330.8270.362E0.5240.6070.5330.4190.4030.4790.5810.6270.4980.5040.347F0.2940.3150.3490.3080.3820.2970.3170.4480.3720.3560.351G0.1150.1090.1420.1370.1080.1160.1210.1500.1320.1400.027H123456789101112AS1-32S1-32S2-32S2-32S3-32S3-32S4-32S4-32S5-32S5-32阴性对照BS1-64S1-64S2-64S2-64S3-64S3-64S4-64S4-64S5-64S5-64阴性对照CS1-128S1-128S2-128S2-128S3-128S3-128S4-128S4