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选修1课时13多聚酶链式反应扩增DNA片段班级:__________姓名:__________设计人__________日期__________课前预习·预习案学习目标11．体验PCR常规的分子生物学实验方法。2．理解PCR的原理。3．讨论PCR的应用。自主梳理11．PCR原理：(1)概念：PCR，即________，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，是一种体外迅速________的技术。(2)原理。①DNA变性：在________的温度范围内，________解体，双链分开的过程。②DNA复性：当________后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链的过程。③DNA合成：DNA聚合酶从引物的________开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的________向________延伸。(3)条件2．PCR的反应过程：(1)循环次数：一般是________次。(2)过程。①变性：当温度上升到________时，双链DNA________。②复性：温度下降到________，两种引物通过________与两条单链DNA结合。③延伸：温度上升到________，溶液中的四种脱氧核苷酸在________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(3)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈________扩增。3．PCR的实验步骤：准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上↓移液：用________按照配方在微量离心管中依次加入各组分↓混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液________↓离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在________↓反应：将离心管放入________中，设置程序进行反应4．PCR的操作提示：(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的一些用具及缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行________。(2)PCR所用的缓冲液和酶应________，并在________下储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都________。所有成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液________。5．DNA含量的测定：稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释↓对照调零：以________作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零↓测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值↓计算：DNA含量(μg/mL)=________________________预习小测11．判断正误：DNA聚合酶能延伸子链的3＇端或5＇端。2．判断正误：PCR反应始终在高于70°C的条件下进行。3．判断正误：TaqDNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加。4．判断正误：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。5．判断正误：高压灭菌的微量移液器枪头每吸取一种试剂后不需要更换。6．判断正误：做PCR使用的微量离心管是一种薄壁玻璃管。♒♒♒♒♒♒♒知识拓展·探究案♒♒♒♒♒♒♒探究1PCR技术的基本原理及条件11．PCR技术的概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种________迅速________________的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2．PCR技术的原理：(1)DNA的热变性在________°C的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，________分开，这个过程称为________。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。(2)子链的合成①需要________；②合成方向总是从子链的________________。3．PCR技术的条件(1)__________模板。(2)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种__________。(3)四种脱氧核苷酸。(4)耐热DNA聚合酶，一般用__________DNA聚合酶。(5)需要一定的__________和能严格控制__________的温控设备。4．PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(一0H)末端称为3'端，而磷酸基团的末端称为5'端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3'端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。5．PCR原理——DNA的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上是一台能够自动控制温度的仪器。6．TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是从一种水生嗜热菌Taq中分离提取的。Taq是一种嗜热细菌，能在70〜75°C环境中生长，该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中发现的。TaqDNA聚合酶的发现解决了高温使普通的DNA聚合酶失活的矛盾。典例精析1(PCR的原理)下列关于DNA复制和PCR技术的叙述，正确的是A.两者都能使DNA扩增，反应条件基本相同，即模板、原料及所需酶相同B.前者所需引物是DNA单链，后者所需引物是RNA单链C.两个过程中所需的DNA聚合酶是完全相同的物质D.PCR技术中，DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸变式训练1如果在案件侦破过程中，搜集到一根毛发，但它所含的遗传信息量太少，该怎么办呢？探究2PCR的反应过程及实验操作与评价17．PCR的反应过程(1)过程PCR—般要经历30多次循环，每次循环可以分为_______、_______和_______三步，所需要的温度分别约为:________°C、________°C、_______°C。从第二轮循环开始，上一次循环的产物作为模板，参与反应，并且由_______延伸而成的DNA单链会与_结合，进行DNA的延伸。(2)结果DNA聚合酶能特异的复制处于______________的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_______扩增。8．PCR的实验操作：(1)实验用具①PCR仪:该仪器能自动调控______________，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。②微量离心管：总容积为_______，实际上是进行______________的场所。③微量移液器：用于_______PCR配方中的液体。(2)操作步骤准备→加入组分→混合→______________→反应(3)操作提示①为避免___________等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行___________。②所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在一20aC储存。③在___________中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。9．DNA含量的测定(1)测定方法紫外分光光度计法。(2)步骤①反应液稀释：取2μL_________反应液，添加98μL________。②分光光度计调零:将100_________添加到_________中，在________处将分光光度计读数调整为________。③将100μL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。④计算：DNA含量(μg/mL)=__________________。10．PCR反应的条件(1)稳定的缓冲液环境PCR反应需要在一定的缓冲溶液中，提供DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶。(2)能严格控制温度变化的温控设备11．PCR的反应过程(1)变性在80〜100°C条件下，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。(2)复性在25〜65℃条件下，系统温度降低，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合，形成局部双链。(3)延伸在70〜75℃条件下，在TaqDNA聚合酶(在72℃左右活性最高)的作用下，以溶液中的四种脱氧核苷酸为原料，从引物的5'端到3'端方向延伸，根据碱基互补配对原则合成与模板链互补的DNA链。特别提醒:PCR的结果(1)PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作模板参与反应，并且由引物I延伸而成的DNA单链会与引物II结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增。(2)PCR—般要经历30多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为230。12．PCR反应的实验操作(l)PCR仪PCR仪自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸第1次94℃,5min――30次94℃，30s55℃，30s72°C,1min最后一次94°C,1min55℃,30s72℃，1min若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替。三个恒温水浴锅的温度分别为94℃、55℃和72℃，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)操作步骤准备:按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验↓桌上移液:用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各↓组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁↓离心:将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是↓使反应液集中在离心管底部反应:将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(3)实验中DNA含量的测定理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。13．PCR技术的实验操作评价如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有:漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。特别提醒：PCR反应体系的配方是经多次实验后确定的，各种成分的用量基本能满足实验反应需要。实验时，不要过多增加用量，以免造成浪费。PCR的反应成分包括稳定的缓冲液环境、DNA模板、两种引物、脱氧核苷酸混合液、TaqDNA聚合酶。典例精析1标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是A.95°C、55°C、72°CB.72°C、55°C、95°CC.55°C、95°C、72°CD.80°C、55°C、72°C变式训练1使用PCR仪的具体实验操作顺序应为①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部A.②③⑤④①B.①⑤③②④C.②③⑤①④D.④②⑤③①随堂自测11．下列说法不正确的是A.一条DNA母链只有一个3'端，即羟基末端B.DNA的两个3'端位于相反的两端C.TagDNA聚合酶只能与引物的3'端结合并延伸子链D.DNA的合成方向是从子链3'端向5'端延伸的2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是A.92℃、50℃、72℃B.72℃、50℃、92℃C.50℃、92℃、72℃D.80℃、50℃、72℃3．在DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是4．假设PCR反应中有2个DNA的片段作为模板，在5次循环后反应物中大约有多少个这样的DNA片段A.64B.32C.16D.85．聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述30多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是A.95℃高温破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C.延伸过程中需要热稳定DNA聚合酶和四种dNTP(合成DNA的原料)D.引物为一小段RNA6．如图为DNA变性和复性示意图，下列相关说法正确的是A.向右的过程为加热(80〜100℃)变性B.向左的过程是DNA双链迅速致冷复性C.变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D.图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3