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GSTpulldown操作流程一、表达GST融合蛋白1、6mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜2、5ml菌液加入400mlLB＋Amp的1L锥形瓶中中，37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.83、取1ml菌液保存于Ep管中，sample14、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h5、取1ml菌液保存于Ep管中，sample26、诱导后的收菌，6000rpm×8min4度，去尽上清，置于冰上7、加入20ml，－20度预冷的PBS+1%Triton-100+PMSF（1：100PMSF）（先加15ml，再加5ml）吹打混匀8、（1）压力破碎仪破碎（2）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总20分钟。至裂解液清澈9、14000rpm，20分钟，4℃离心，分离上清，取50ulsample310、取GST-Beads（400ul）到柱子管中，用预冷的PBS洗去其中的Triton－x－100，加上清（？），4度，旋转孵育1h如果是小量纯化，就是50ul的GST-beads放EP管，加细菌裂解液1ml11、收集50ul的样品sample4，可与sample3作对照，检测beads的结合效率12、用-20度预冷1％的Triton－x－100inPBS洗3次，PBS洗3次1000转2min，弃上清，留beads等体积的液体（小量PBS是1ml洗，多次）13、用大枪头剪去少许（beads：PBS=1:1）,吸出10ul跑样，检测纯化情况14、sample1，2，3，4加samplebuffer，100度10min，12000rmp30sSDS－PAGE每样10ul15、4度保存GST－pro-beads（如果不做pull-down,可以洗脱）sample1：诱导前sample2：诱导后sample3：上清sample4：纯化后上清二、裂解细胞1、收集细胞（胰酶处理好，防止细胞破碎）1000rmp，5min，RT2、PBS洗，离心1000rmp，5min3、加400ulIPlysisbuffer（0.1％Triton）1：100加cocktail冰上孵育30minIPLysisbuffer500ml：HEPES5.95gNacl4.38gEGTA0.38gPH=7.44、针头过5次5、冰上，旋转孵育，15min6、14000rpm，20min，4度，留上清，去沉淀三、表达纯化HIS－taggedprotein1、500mlLB高温灭菌2、接种单克隆到5mlLB，加抗生素，37度，250转，过夜3、把菌液转移到500mlLB,加抗生素中，37度，250转，OD~0.7（看到云雾）4、加入IPTG250－500ul，诱导4小时（温度摸索）5、6000转，4度，15min，弃上清，用10mllysisbuffer溶解沉淀6、加入50ulPMSF，超声破碎，（300w，工作5，间歇10，全程10min）7、12000转，4度，20min8、柱中加入1mlni-beads，上清转移至柱中，4度，旋转孵育1小时，（每种蛋白需要自行摸索相应的最佳条件，为防止蛋白降解，以下均在冰上）小量就是50ul的NI-beads放EP管，加细菌裂解液1ml9、用Washbuffer110ml每次，洗2次（小量是1ml洗）用Washbuffer25ml每次，洗2次（小量是1ml洗）,收集洗脱液电泳检测每种washbuffer的最佳用量（防止将蛋白洗脱）10、用Elutionbuffer洗脱蛋白2-4次，每次0.5ml，取1ul洗脱液在NC膜上，丽春红染色，颜色越深，蛋白量越大，取蛋白量最大的做Pulldown试剂配置：Lysisbuffer50mMNaH2PO4，PH8.0300mMNacl10mMImidazoleWashbuffer150mMNaH2PO4，PH8.0300mMNacl20mMImidazoleWashbuffer250mMNaH2PO4，PH8.0300mMNacl40mMImidazoleElutionbuffer50mMNaH2PO4，PH8.0300mMNacl300mMImidazoleElutionbuffer40ml50mMNaH2PO40.312g300mMNacl0.701g300mMImidazole0.8171g三、pulldown实验1、his-pro加入到已纯化的GST-Pro的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！2、4℃旋转结合，4h3、PBS+0.1%Triton-100洗3次，PBS洗3次，1000转2min，1:1留。4、loadingbuffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，5、高速离心，RunSDSPAGE做WesternBlot检测。四、半pulldown实验1、分配好zeta－GST到EP管中，其蛋白量与GST－beads上的GST蛋白量一致10ulzeta－GST－beads（beads：PBS＝1：1）即=5ulGST-beads取50ulzeta－GST－beads（beads：PBS＝1：1）5ulGST-beads用GST-beads空补剂2、4度4h3、IPLysisbuffer洗