环境工程微生物学实验讲义

环境工程微生物学实验讲义实验一光学显微镜的使用一、目的要求1、熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。2、了解油镜的原理，并掌握其使用方法。3、学习生物图的绘制方法二、实验内容学习普通光学显微镜的使用方法，学会判断是否需要使用油镜，学习理解，学习怎样使用和利用光圈，反光镜，调整反差，使视野达到最好的观察效果。学习使用油镜观察微生物标本示范片。观察的示范片有，细菌三型涂片、葡萄球菌涂片、枯草芽孢杆菌涂片、褐球固氮菌涂片、八叠球菌涂片、猪链球菌涂片，青霉、曲霉示范片等。三、实验器材显微镜、各种示范片、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。四、方法步骤1用低倍镜对（调）光，使视野明亮。2选择要观察的标本片，首先在低倍镜观察（寻找观察目标）。3高倍镜观察（选取理想的观察目标）。4油镜观察：高倍镜观察后――上升镜筒（或者是下调载物台）――油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴香柏油――小心地下降镜筒使镜头浸在油里――用粗螺旋将镜筒（载物台）缓慢上升，寻找目标（物象）――用细螺旋调节，使物象清晰――观察记录。5观察完毕。上升镜筒（或者是下调载物台），转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。6将显微镜各部分还原至进实验室时模样。五结果与思考1绘图记录观察结果（以细菌三型为例）细菌三型涂片观察放大倍数目×10物×100_细菌三型涂片观察放大倍数目×10物×1002油镜完毕后，镜头应如何处理?六、讲解时的注意事项：1、本次实验为学生第一次进入微生物实验室，因此在开始实验时必须向学生交代实验室的一些规章制度及注意事项。2、对显微镜的介绍从原理到各部件到使用都务必详细，包括使用过程中应该注意的事项，尽量减少学生用坏仪器的几率。3、一定要详细讲解观察时视野内的反差调节，提高学生的实验效率。4、要提醒学生要掌握正确的观察方法，左眼观测，右眼用于画图或记录。养成良好的观察习惯。5、要要求学生实验报告绘图时必须采用铅笔。6、要强调油镜护理的重要性。实验二藻类、原生动物及微型后生动物个体形态的观察（水处理中常见微生物的观察或活性污泥的观察）一、目的要求1进一步熟悉和掌握普通光学显微镜的使用方法。2掌握生物图的绘制方法。3学习压滴法制作标本片。二实验内容用显微镜观察活性污泥。三实验器材1、实验室提供的水样：活性污泥混合液、生物滤池水样、SBR反应器水样、生物接触氧化池水样2、学生自取水样（让学生来实验室之前自选地点取样，记录采样地点）3、显微镜、吸水纸、擦镜纸。四方法步骤1、用压滴法制作藻类、原生动物和微型后生动物的标本片。2、低倍镜观察（寻找观察目标）。3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。4、绘制藻类、原生动物和微型后生动物的形态图。五结果与思考1绘图记录观察结果藻类观察放大倍数原生动物观察微型后生动物观察放大倍数放大倍数2你观察到几种微生物？来自不同水样观察到的结果是否不同六、讲解时的注意事项：1、要再一次强调显微镜的正确使用方法。2、再一次强调反差的作用。3、示范压滴法制作生物标本片的过程4、结合课堂内容，让学生明白使用显微镜观测活性污泥的意义，鼓励学生多做示范片，多认识几种原生动物等。5、再一次强调正确的观察方法。6、再次提醒学生注意使用铅笔绘图。7、提及PFU生物监测法，告诉学生此为开放实验，有兴趣的学生可以选择在实验结束选做。实验三、四微生物细胞计数和大小的测量一目的要求1学习掌握血球计数板进行微生物计数的方法。2学习掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法。二实验内容1用血球计数板计算酵母菌悬液中，每毫升原液的菌数。2用测微尺测量生物示范片中微生物的大小。三实验器材1菌种：酿酒酵母。2仪器及其它：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸、各种生物示范片。四方法步骤（一）微生物显微镜直接计数法1制备酵母菌的菌悬液。2取血球计数板一块，先用眼睛观察其结构，然后在低倍镜下观察计数室的网格结构。3将盖玻片放在计数器的网格上方使之架起。4用滴管吸取少许摇匀的酵母菌悬液，从盖玻片的一端注入，使酵母菌悬液渗入两玻片之间（应无气泡，盖玻片不顶浮）。5将计数板水平静置5分钟使菌液分布均匀后计数，。6用低倍镜寻找计数器的网格，然后在高倍镜下按下述原则对上下两个计数室内的酵母菌进行计数。即：采用五点取样法（25×16）或四点计样法（16×25）各计上不计下、计左下计右的原则计数五个或四个中格中的酵母菌数。7计算原菌液中含酵母菌数每ml原液中含酵母菌数=两次计数总酵母菌数/(2×80)×400×104×稀释倍数每ml原液中含酵母菌数=两次计数总酵母菌数/(2×100)×400×104×稀释倍数（二）微生物大小测定1目镜测微尺的校正（1）目镜测微尺装入目镜的隔板上，刻度朝下，将镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。（或将带有目镜测微尺的目镜头换上）（2）从目镜中观察“目尺”的结构后，用低倍镜寻找镜台测微尺（先找黑圈，再稍加移动）。（3）移动台尺和转动目镜，使两尺平行，并把两测微尺一端的第一条线完全重叠，然后寻找另一端的一条完全重叠的线。（4）记下两重叠线之间的格数，并依下列公式求出校正值。校正值（微米）=两重叠线间镜台测微尺的格数/两重叠线间目镜测微尺的格数×10微米（5）用同样的方法，求出高倍镜下目镜微尺的校正值。2测量细菌的大小（6）取下台尺，换上生物示范片。（7）在油镜下测量每种细菌的3个细胞的大小。五结果与思考1填表：表一微生物的显微计数（25×16）12345小计总数细胞数/mL1室2室表二不同物镜倍数的校正值物镜镜头镜台测微尺（格数）目镜测微尺（格数）校正值低倍镜高倍镜油镜表三油镜下细菌细胞大小的测定测量次数细菌名称测量参数目镜测微尺（格数）细胞实际大小1球菌直径杆菌长宽螺旋菌长宽2球菌直径杆菌长宽螺旋菌长宽3球菌直径杆菌长宽螺旋菌长宽2为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？3目镜测微尺在用前为什么要校正？六、讲解时的注意事项1、实验讲解务必详尽，不仅要跟学生讲实验原理，还要讲每一步操作的注意事项，比如在利用血球计数板计数时，如何找到计数室所在，利用测微尺校正时如和快速在油镜下找到镜台测微尺。这样使学生的实验效率提高，可以提高学生实验兴趣。2、示范利用血球计数板计数时，菌液如何添加。3、强调测量大小时校正的原则：边对齐，整数格（不能出现小数），找最远的重合线。计数要防止重复计数注意的原则：数上不数下，数左不数右。实验五微生物染色法一目的要求1学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。2了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。二实验内容1分别以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus）、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌（E.coli）为材料进行革兰氏染色，并通过显微镜观察，判断其反应类型。同时说明单染色的操作技术和无菌操作技术。2学习掌握细菌芽孢染色方法。三实验器材1菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。2显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。3草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀绿溶液。四方法步骤（一）单染色步骤1涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3固定：涂面朝上，通过微火2-3次。4染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。6干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。7镜检：油镜观察并绘图。（二）革兰氏染色步骤1涂片：取清洁玻片一块，并滴一滴蒸馏水，将菌种涂布在蒸馏水中。2干燥与固定：方法同（一）中2，3步骤。3染色：结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液媒染1-2分钟--水洗--酒精脱色15-20秒--水洗--番红复染色2-3分钟--水洗--干燥--镜检记录。（三）细菌的芽孢染色1制备菌液：加1-2滴蒸馏水于试管中，从斜面挑取2-3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。2加染色液：加5%孔雀绿2-3滴于试管中用接种环搅拌，使其充分混合。3加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15-20分钟。4涂片：从试管底部挑菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜，晾干。5固定：将涂片通过微火3次。6脱色：水洗，直到流出的水中无绿色为止。7复染：加番红染色2-3分钟后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸去余水，于酒精灯火焰上烘干。8镜检：用油镜观察绘图。五、结果与思考1绘图记录观察结果（只要求记录革兰氏染色结果）革兰氏染色放大倍数__×__菌种______颜色______属性_____革兰氏染色放大倍数_×__菌种______颜色______属性______革兰氏染色放大倍数_×__菌种______颜色______属性______2在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？3革兰氏染色中哪一步关键，为什么？六、讲解时的注意事项1、要强调无菌操作的重要性。2、示范无菌操作。3、强调挑菌、涂片过程应注意事项，挑菌不宜太多。否则涂片太厚4、示范革兰氏染色全过程5、强调酒精脱色的重要性6、强调涂片必须干燥后才能置于油镜下观察实验六细菌淀粉酶和过氧化氢的定性测定一实验目的通过对淀粉酶和过氧化氢的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。二实验器材1药品及试剂：肉膏胨、淀粉琼脂培养基1瓶（约50mL）；0.2％淀粉溶液1滴瓶、革氏碘液1滴瓶、3～10％过氧化氢1滴瓶；2菌种枯草杆菌和大肠杆菌其他来源的细菌如土壤悬液3仪器及其它试管4支、试管架1个、培养皿2套、接种环三实验内容1枯草杆菌培养液中淀粉酶的测定2细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验3过氧化氢酶的定性测定四方法步骤（一）枯草杆菌培养液中淀粉酶的测定1取4支干净的试管，按1、2、3对照编号。放在试管架上备用。2在1、2、3号试管中分别加入5、10、15mL的枯草杆菌培养液，再在1、2号试管内分别加入10、5mL蒸馏水。在对照管内加入15mL蒸馏水。31、2、3号试管中分别加入0.2％淀粉溶液若干滴，迅速摇匀并记下反应的初始时间。4在以上4个试管内分别滴加若干滴碘液，迅速摇匀，这时各管均呈蓝色。5观察结果。注意各管的变化，记下各管蓝色完全消失的时间，并对结果进行分析。（二）细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验1将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45℃左右倒入无菌培养皿内（每皿约10mL），共倒5个，静置待冷凝即成平板。2在无菌操作条件下，所有的平板在培养皿底部贴好标签后，用接种环分别挑取枯草杆菌和大肠杆菌分别在2个平板上点5个点。再打开一个平板，在空气中放置30分钟，盖上培养皿盖，剩余的两个平板处理如下：一个接种土壤悬液，另一个让学生用手在平板里氨手印，或取硬币在平板里按一下，或打开培养皿盖，摇摇头等，所有平板倒置于37℃恒温培养箱内培养24-48小时。3观察结果，取出平板，分别在2个平板内菌落周围滴加碘液，观察菌落周围颜色的变化。并记录结果。（三）过氧化氢酶的定性测定1将配备的枯草杆菌和大肠杆菌斜面各1支放在试管架上。2用滴管吸取过氧化氢滴加入两管菌种斜面上。3分析结果，把所观察到的现象记录下来，进行分析。五结果与思考表一枯草杆菌培养液中淀粉酶的测定结果记录与分析试管蓝色消失时间结果分析对照管1号2号3号表二细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验结果记录与分析培养皿菌种淀粉酶产生情况结果分析1号2号注：产生记为阳性“+”，不产生记为阴性“－”。表三过氧化氢酶的定性测定结果记录与分析试管菌种过氧化氢酶有无结果分析1号2号注：有记为阳性“+”，无记为阴性“－”。讲解注意事项：1、对实验结果的讲解要与理论相结合，要告诉学生为什么会有这种现象发生。2、让学生对酶的理解进一步加深。启发学生思考淀粉酶是胞内酶还是胞外酶，理解不是所有的细菌都能利用淀粉。注意对实验现象的引