CTAB法提取总DNA

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资源描述

CTAB法提取槐树总DNA⑴分别精称1.0g槐树新鲜叶片,去主脉,放入研钵。⑵用液氮将叶片组织研磨成细粉,然后将粉末分装于2mL离心管中。⑶各离心管中加入65℃预热的2×CTAB抽提液1000µl和β-巯基乙醇4µl,混和使之充分湿润,于65℃水浴锅中温育1.5h,不时混匀。⑷12000rpm离心10min,将上清液转移至新的离心管中,弃沉淀。⑸上清液中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)(v/v),抽提上清,颠倒混匀7min,12000rmp离心10min。⑹将离心后所得的上清液体转移至新离心管;每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)(v/v),再次抽提上清液,12000rpm离心10min,上层液体转移至新管。⑺每管加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH8.0)和等体积的异丙醇,轻轻翻转混匀,置-20℃冰箱中冰浴30min~1h,沉淀DNA。⑻12000rpm离心10min,弃上清。⑼用70%酒精和无水乙醇各洗涤沉淀一次,分别离心2min自然干燥。⑽加50µlTE缓冲液溶解DNA;保存于-20℃的冰箱中备用。⑾DNA浓度及质量检测:取3μLDNA提取液,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。琼脂糖凝胶电泳①制备凝胶(1%或1.5%琼脂糖凝胶),将1×TAE电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中经高温融化,混匀,冷却至55℃,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。②待胶凝固后,从制胶平台上拔出梳子,放入加有足够1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中,缓冲液高出凝胶表面1mm。③用适量加样缓冲液制备DNA样品,然后用微量移液器将样品加入样品孔中。一定要包括合适的DNA分子量标准物。④接通电源,进行电泳使DNA向阳极移动。⑤当加样缓冲液中的溴酚篮迁移至足够分离DNA片段的距离时(即:溴酚篮迁移至距凝胶底部约1cm),关闭电泳。⑥将电泳完的凝胶放入含有溴化乙锭的溶液中染色15~20min。⑦染色完的凝胶可以直接放在紫外呈像系统上照相。槐树RAPD反应体系和程序⑴反应体系:25µl/管ddH2O19.05µl10×Buffer2.5µlMgCl2(25mmol/L)1.5µldNTP(10mmol/L)0.5µl随机引物(50µmol/L)0.25µlTaqDNA聚合酶(5U/µl)0.2µl模板DNA1.0µlTotal25.0µl⑵反应程序:预变性94℃5min变性94℃1min退火36℃1min40个循环延伸72℃2min延伸72℃10min药品配制1.2×CTAB抽提液:2%(W/V)CTAB100mmol/LTris·cl,pH8.020mmol/LEDTA,pH8.01.4mol/LNacl2.1mol/LTris·cl,pH8.0称取一定量的Tris溶于水中,用盐酸(Hcl)调pH值至8.0,定容。3.0.5mol/LEDTA,pH8.0称取一定量的EDTA-Na2溶于水中,用NaOH调pH值至8.0,定容。4.3mol/LNaAc(pH5.2):称取一定量的NaAc溶于水中,用冰醋酸(乙酸)调pH值至5.2,定容。5.酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),氯仿/异戊醇(24:1):6.TE缓冲液:10mmol/LTris·cl,pH8.01mmol/LEDTA,pH8.07.TAE电泳缓冲液(50×贮存液,pH约8.0):242gTris碱57.1mL冰醋酸37.2gNa2EDTA·2H20加H20至1L(使用时稀释到1×工作液)8.异丙醇,70%酒精,无水乙醇。

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