6第六章外源基因的表达2

1第六章外源基因的表达2五、酵母表达系统酵母（yeast）——是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。3酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。41、酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由：酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）、宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。5①DNA复制起始区酵母表达载体包含两类复制起始序列：在大肠杆菌中复制的复制起始序列在酵母菌中引导进行自主复制的序列6②选择标记营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。G418：氨基糖苷类抗生素Cycloheximide：蛋白合成抑制剂7③有丝分裂稳定区酵母菌表达载体在细胞内拷贝数少，分子质量较大，相当于微型染色体。表达载体上的有丝分裂稳定区，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。8④表达盒表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达载体的重要元件。分泌信号序列是前体蛋白N端一段长为17～30个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。92、酵母基因表达载体的种类（1）自主复制型质粒载体（yeastreplicatingplasmid，YRP）该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。优点：在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个。缺点：经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。10（2）整合型质粒载体（yeastintegrationplasmid，YIP）整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换（插入）整合和双交换（或替换）整合两种方式。11（3）着丝粒型质粒载体（yeastcentromericplasmid，YCP）该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有1～2个拷贝。12该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有单拷贝。在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。酵母菌选择标记基因赭石突变抑制基因SUP4表达时菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的重组转化子。YAC载体可插入200～800kb的外源基因片段，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。（4）酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）133、酵母基因表达系统宿主菌主要包括酿酒酵母*巴斯德毕赤酵母乳酸克努维酵母多型汉森酵母144、在酵母中高效表达外源基因的策略选择合适的受体细胞系统提高表达载体在细胞中的拷贝数提高外源基因的转录水平15六、哺乳动物细胞基因表达系统哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因表达调控更加复杂。要表达具有生物学功能的蛋白质和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工等过程。161、哺乳动物基因表达载体的组成特征哺乳动物基因表达载体质粒载体病毒载体哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒，能够在细菌（大肠杆菌）和哺乳动物细胞中进行扩增。17哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：基因的转录元件：即转录的启动子、增强子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号等；用于筛选转化子的选择标记；在细菌中进行复制和筛选的元件；基因表达的调控元件。18（1）复制子表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，带有这些复制子的表达载体能以附加体的形式进行复制。通常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。19（2）启动子和增强子表达载体的启动子长为100～200bp，位于转录起始位点上游。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒。病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。20（3）终止信号和加poly(A)信号RNA聚合酶的转录终止和加poly(A)信号依赖于DNA模板上两种特异的序列，一是位于poly(A)位点上游11～30个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA，二是poly(A)位点下游的GU丰富区或U丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。21常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的BamHI-BclI限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。22（4）剪接信号外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)信号后，内含子被剪除并形成成熟的mRNA。mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5′和3′边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。若外源基因为cDNA，表达载体中不含内含子剪接信号，也不会影响其表达。23（5）选择标记基因为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：24252、哺乳动物基因表达载体不带真核复制起始序列的质粒型载体（整合）带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体SV40衍生的表达载体牛乳头瘤病毒（BPV）衍生载体人疱疹病毒（EBV）衍生的表达载体人腺病毒（adenovirus）衍生的表达载体反转录病毒（retrovirus）衍生的表达载体263、哺乳动物基因表达宿主细胞哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。27•CHO-K1细胞CHO-K1细胞——中国仓鼠卵巢的上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr－）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10μg/ml以上。二氢叶酸还原酶可降解氨甲蝶呤氨甲蝶呤可抑制DNA和RNA的合成。28①外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；②适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；③对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；④细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素β、干扰素γ、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。CHO-K1细胞特点29•COS细胞它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达SV40的大T抗原。COS细胞的特点：①细胞来源丰富；②细胞易于培养和转染；③能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增；④能瞬时大量表达外源基因的产物。30由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。31•鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。鼠骨髓瘤细胞的特点：①细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；②能进行分泌表达，且表达量高；③能对蛋白质进行糖基化修饰。324、提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略（1）设法提高外源基因的表达水平和产量（2）改造宿主细胞的特性（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期（4）提高表达蛋白糖基化水平33七、植物细胞基因表达系统（自学）34第四节基因表达产物的检测与分离纯化p389一、基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。检测特异性mRNA的方法Northern杂交法检测特异性蛋白质的方法生化反应检测法免疫学检测法生物学活性检测法351、外源基因转录产物的检测Southern杂交可以检测到外源基因是否存在于受体细胞中，但不能确定外源基因是否转录。而利用Northern杂交技术可以检测外源基因是否转录出mRNA。检测外源基因转录产物还可采用RT-PCR的方法。362、报告基因的酶法检测报告基因必须具备两大特点：其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中并不存在；其表达产物便于检测。37报告基因一般是编码酶的基因哺乳动物细胞基因工程中：氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）等。植物基因工程中：GUS基因、CAT基因、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因）、荧光素酶基因和抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。38cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源性活性，因而cat基因可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因。cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表达。cat的活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定，目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。•cat（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测39•gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因的检测gus基因存在于某些细菌体内，编码β-葡萄糖苷酸酶，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的gus活性，许多细菌及真菌也缺乏内源gus活性，因而gus基因被广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在基因外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用得最多。常用于gus基因检测的底物对应的检测方法5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）组织化学染色定位法4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）荧光测定法对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）分光光度测定法40•荧光素酶基因的检测用作报告基因的荧光素酶主要来自细菌或萤火虫。萤火虫荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，在Mg2+、ATP及O2作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转变成光能。荧光素＋ATP+O2氧化荧光素＋CO2+AMP+PPi+光萤火虫荧光素酶细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，需要还原型的黄素单核苷酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。RCHO+O2+FMNH2RCOOH+H2O+FMN+光细菌荧光素酶检测方法有两种：活体内荧光素酶活性检测体外荧光素酶活性检测41•dhfr（二氢叶酸还原酶）基因的检测dhfr基因又称氨甲蝶呤抗性基因，编