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第二章细胞分化的分子机制——转录和转录前的调控基本概念细胞分化celldifferentiation:是指同群结构与功能相同的细胞发生一系列的内外变化，成为结构与功能不同的细胞的过程。分化过程涉及基因活性状态变化、细胞内物质组成的变化和功能的变化以及形态结构的变化。细胞表型cellphenotype：是细胞特定基因型在一定的环境条件下的表现，是细胞的特定性状。totipotentcell:产生有机体全部细胞表型细胞pluripotentcell:产生几种特定类型的细胞differentiatedcell:多潜能细胞通过分离和分化发育成的特殊细胞表型个体发育的过程：全能性细胞→多潜能性细胞→分化细胞，基因选择表达（表型）•细胞分化过程中基因差异性表达的条件和原因：前提条件：携带有丰富的遗传信息及复杂的表达调控机制细胞内环境：卵质不均匀分布原因细胞外环境：细胞间相互作用（位置不同，接收的信息不同）。•差异基因表达的调控机制：差异基因转录：调节哪些核基因转录成RNA；核RNA的选择性加工：不同的拼接将导致同一条核RNA产生不同的转录子；mRNA的选择性翻译：调节哪些mRNA翻译成蛋白质；差别蛋白质加工：选择哪些蛋白质加工成为功能性蛋白质Genomeequivalence——同一有机体的多种细胞具有完全相同（基因组相同）的一套基因结构一、有机体不同组织基因组相同的证据1、遗传学证据：果蝇：•在整个幼虫期和成体的不同组织细胞中染色体的数目相同;•同一个体不同组织细胞提取的DNA数量是一致的第一节基因组相同和基因差异表达2、胚胎学证据：已分化的细胞仍具有发育成为其它细胞的潜力海胆（早期细胞全能性）、蝾螈（早期背唇）A、转决定（transdetermination）：移植成虫盘（果蝇器官原基，命运已决定细胞）实验--眼成虫盘移植到另一个幼虫的腹部，后者腹部长出一只眼睛。已决定的细胞，发育命运稳定；--触角成虫盘多次移植后，部分触角成虫盘细胞分化形成成体果蝇的腿、翅、嘴。已决定但尚未终末分化的细胞，突然改变了它的发育程序的事件——转决定B、转化（metaplasia）：已分化的细胞转分化为其它类型细胞的现象e.g.,鸡视网膜表皮色素细胞在含透明质酸酶、血清、苯硫脲的条件下培养后转变为晶体状细胞。核移植实验3、分子生物学证据：核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）：有机体不同组织细胞中拥有序列完全相同的核基因组DNA；原位杂交（insituhybridization）：许多已分化细胞仍含有不表达的其它组织转移性基因1、在发育中核潜能被限定移核试验（豹蛙）：发育时期越晚，细胞核潜能的受限性越大二、核潜能的限定合子核→分化细胞核（全能性）→（多潜能性）去核受精卵囊胚核原肠胚早期内胚层核神经胚内胚层核50%蝌蚪，异常个体以内胚层细胞形成较其他胚层细胞更容易﹤10%蝌蚪80%以上蝌蚪结论：随着发育，体细胞的核潜能存在普遍的受限现象，且具有供体核的特异性2、细胞核具有潜在的全能性核克隆：结论：已分化的细胞核基因组具有产生全部细胞类型的潜能克隆哺乳动物的技术路线1、基因删除：原生动物、线虫、昆虫、甲壳动物。2、基因扩增：爪蟾的rDNA、果蝇多线染色体。3、基因重排：免疫球蛋白基因（106~108种抗体）。三、基因组相同的例外——基因组的变化•副蛔虫染色体消减•瘿蝇等卵裂时，部分染色体丢失，丢失的→体细胞；不丢失的→生殖细胞。如：瘿蝇40→8；摇蚊40→38•哺乳类（除骆驼）的红细胞、皮肤的羽毛、毛发角化细胞中整个细胞核丢失1、染色体消减2、基因扩增A、基因的选择扩增（geneselectiveamplification）：某些特殊基因被选择性复制出许多拷贝的现象非洲爪蟾rDNA扩增,从变态期开始，一直到卵母细胞成熟之前；初级卵母细胞末期，其rDNA为体细胞的2×105倍果蝇卵壳蛋白基因——滤泡细胞中超量DNA合成（16倍）B、基因组扩增（genomeamplification）：通过多倍体和多线染色体扩增完整基因组•哺乳动物肝细胞（营养原细胞）——多倍体扩增•果蝇卵巢中营养细胞——多线染色体扩增rDNA——核糖体RNA基因5’前导序列转录间隔3、基因重排•免疫球蛋白的基因重组•淋巴母细胞在为抗体制备作准备时，组合多个独立的遗传程序（体细胞重组），其间，它总是试图将抗体轻链或重链的DNA序列随机编排成受体或抗体的可变区，以增加识别和结合未知外来抗原的机会B淋巴细胞：C区编码恒定区V，D，J编码可变区第二节染色质水平基因活性的控制一、染色质chromatin常染色质和异染色质化（DNA高度螺旋化）结构型：DNA序列的折叠状况始终不变异染色质也从不转录，但可调节基因表达机动型：某些情况下，DNA折叠可以改变，成为常染色质，进行转录，有些情况反之异染色质化过程：指具有转录活性的常染色质失去转录活性（一种高度固缩状态），成为异染色质的过程（基因沉默）。X染色体失活（长臂所有基因失活，短臂部分基因未失活）•哺乳类X性染色体（♀）；•多为随机失活；少为选择性失活（父源，小鼠滋养细胞、袋鼠胚胎细胞）；•表达剂量补偿，凝血因子基因；•近年：xist基因有调控小鼠发育中X染色体失活的功能哺乳动物失活的X染色体在生殖细胞形成时才重新恢复活性状态。二、选择性基因转录的染色质变化染色体蓬松区——染色体上DNA解螺旋的区域，是基因转录活跃区•蓬松区的有无或者位置，具有组织和发育时期的特异性（一）、染色体疏松区（puffregionofchromosome）•蜕皮素具有调控果蝇唾液腺细胞染色体蓬松区形成的作用（与染色体上的特殊部位结合）•蜕皮素也能诱导已存在的疏松区退化疏松区所合成的产物对于诱导以后产生的疏松区是必需的（二）、灯刷染色体（lampbrushchromosome）两栖类卵母细胞减数分裂的双线期成对排列的每个染色单体上染色粒向一侧伸出许多DNA的侧环。暂时性的第三节基因转录水平的调控一、基因表达的时间和空间特异性受发育的遗传控制•时间特异性——不同发育时期，基因表达活性不同David（1983）爪蟾，采用减法式克隆技术，构建原肠胚时期特异性的cDNA文库：-分别提取受精卵、原肠胚mRNA，mRNA→cDNA；-两个时期的cDNA杂交，去掉双链杂交分子（两个时期都表达），余下者为在原肠胚时期特异表达的cDNA；-将后者连于载体中得到原肠胚期特异性的cDNA文库。用特异性基因探针做点杂交，便可检测各期特异基因表达用基因芯片技术对各种不同基因的表达谱进行分析•空间特异性——组织特异性（Northernblot，原位杂交）斑马鱼早期发育中vasamRNA的时空表达（原位杂交）（一）、珠蛋白基因在红细胞中的表达调控二、发育中基因表达转录水平的调节与变化b-珠蛋白基因的结构位点控制区——超强启动子区何时表达何种b-珠蛋白，决定于结合在特定珠蛋白基因启动子上的转录因子与结合在LCR上的因子之间的亲和力。例如，敲除b-globin基因的启动子和3’增强子后，成年小鼠的红细胞中仍含大量的-globin;EKLF是b-珠蛋白启动子结合的转录因子，EKLF-/-小鼠成年之后仍表达-和-珠蛋白。•RNA聚合酶III调控5srRNA基因的转录；•TFШA等分子辅助参与RNA聚合酶III对不同启动子区的识别和结合（二）、转录调控蛋白5s核糖体RNA基因转录的调控在发育中，5s核糖体RNA基因表达的调控均在转录水平进行。1、中心启动子元件（非洲爪蟾）5SrDNA启动子区AGCAGGGT55625069A区9080C区A区和C区为有效转录所必需中间启动动子——调控基因转录2、TFШA的转录调节TFIIIA直接与启动子C区结合TFIIIC先与中间启动子结合，TFIIIA+TFIIIC→复合物+RNA聚合酶III→5SrRNA基因转录（三）、转录调控的开关基因•Switchgene:发育中可以决定细胞向两种不同命运分化的基因（主基因的表达决定）•果蝇腹中线外胚层细胞具有分化成为上皮细胞或神经母细胞的双重潜能；notch转录缺乏时，腹中线所有细胞都分化成神经母细胞，胚胎不能正常发育；notch控制分化成皮肤细胞和神经母细胞•myod1转录子是肌细胞分化的主要开关基因，也是肌母细胞决定子。将其通过病毒载体转染其它细胞（如色素细胞、神经细胞、脂肪细胞、肝细胞等），可使它们转分化为肌细胞。（一）、真核生物基因结构•真核生物的结构基因的DNA序列由编码序列和非编码序列两部分组成，编码序列是不连续的，被非编码序列分割开来，称为断裂基因（splitgene）。三、差异基因转录的调控机制•基因种类（依其功能分为）：1、结构Gene---编码蛋白和酶分子结构；2、调控Gene---调节结构基因表达；3、转录而不翻译的Gene：rDNAGene→rRNA→核仁形成区，核糖体组成。tRNAGene→tRNA→转运氨基酸。•外显子和内含子•侧翼序列与调控序列，包括：启动子、增强子、终止子等。1、外显子和内含子1）、外显子（exon）•可编码氨基酸的序列；•一般一个蛋白质的氨基酸序列常有多个外显子构成，这些外显子常被长度不一的内含子所间隔。——β珠蛋白基因（1700bp）=3个外显子+2个内含子。——DMD基因（2300kb）=79个外显子+78个内含子。（迄今认识的最大的基因）β-珠蛋白基因2）、内含子（intron）•非蛋白质编码序列，又称插入序列；•不同基因具有内含子的数目和内含子的长度差异很大；•对前体RNA加工成为mRNA并转运到细胞核外具有重要作用；•真核生物某些结构Gene没有内含子，如组蛋白Gene、干扰素Gene、大多数的酵母结构Gene等β-珠蛋白基因Intron1Intron25`GT——AG3`法则在每个外显子和内含子的接头区都是一段高度保守的共有序列，内含子的5`端是GT，3端是AG，这种接头方式称为GT-AG法则，普遍存在于真核生物中，是RNA剪接的识别信号，转录后的前体RAN中的内含子剪接位点。2、侧翼序列与调控序列每个结构基因的第一个和最后一个外显子的外侧，都有一段不被转录的非编码区（untranslatedregion)，称为侧翼序列（Flankingsequence）。它是基因的调控序列，对基因的有效表达起调控作用，包括：启动子、增强子、终止子等。（二）、真核生物基因转录水平的调控1、顺式作用元件（启动子和增强子）1）、启动子（promoter）：是位于转录起始位点上游的特殊DNA序列，可被RNA聚合酶II及其它转录因子或蛋白质识别并结合，对于决定基因转录起始和保证DNA精确、有效地转录具有极其重要的作用。包括：核心启动子成分：如：在启动子的上游区一般都含有一个TATA框（高度保守），位于转录起始点上游25～30bp（-30～50），可精确地控制转录从起始位点开始；TATA框与转录因子TFII结合，再与RNA聚合酶II形成转录起始复合物，从而准确地识别转录起始位置，对转录水平有定量效应。上游启动子成分：如CAAT框、GC框、GCCACACCC和ATGCAAAT序列，调控转录起始频率和维持基因转录通用转录因子与启动子TATA框序列结合，该因子进一步与RNA聚合酶II结合共同装配成为转录起始复合物，启动转录；此复合物在所有真核细胞转录过程中均出现。TFIIETFIIF真核转录起始复合物的形成转录因子•CAAT框（CAATBox）:是一段保守序列，位于转录起始点上游-70～-80bp,转录因子CTF识别位点并与之结合，激活转录。•GC框（GCBox）:顺序为GGCGGG,有两个拷贝，位于CAATBox两侧，与转录因子SP1结合。（SP1有锌指区可以与DNA结合，在N端有激活转录的作用）GC框有激活转录的功能。2）、增强子（enhancer）：包括启动子上游或下游的一段DNA序列，是大多数基因转录所必需的，可以增强启动子发动转录，提高转录效率；•位置：增强子可以与启动子相隔很远的序列起作用，因此它可以位于基因的3’末段、内含子区域，甚至在互补的DNA