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发育生物学相关技术组织学与胚胎学系肖玲概述•发育生物学是一个多学科的研究领域，它利用一切有关学科的技术方法，也利用它们的研究成果，来研究和解释发育中的问题。例如要了解早期发育时的基因活动，就需要用分子生物学的技术研究受精之前和受精之后以至卵裂时期的RNA，以判断哪些是受精前已有的，哪些是受精后转录的，它们是哪些类型，何时开始、在哪些细胞中转录的；要研究某一结构基因的调节控制，分子遗传学关于原核基因的研究就是不可缺少的基础。•生物学/胚胎学/分子生物学/遗传学科学家追踪到“被复制”基因推动形态学演化2009.9.8•长期以来，生物学研究一直被一个问题所困扰，那就是进化对基因的修修补补为何没有把生命变得一团糟。一种流行的理论认为，基因组拷贝了一些关键的基因，因此一旦有突变破坏了这些基因，生物体还留有一个备份。研究人员追踪到一种被复制的基因---纤维原细胞生长因子受体1(fgfr1)的基因，在这种基因的作用下能够繁殖出所谓的镜子鱼（镜鲤），这些鱼拥有巨大且能够反射光线的鳞片。•发育机制的探索，既可以是分子水平的研究，也可以是亚显微或细胞水平的，如果涉及某些细胞器在细胞分化中的变化和作用；或者如果涉及到不同胚层的细胞在形成某一特定结构中的相互作用，就是更高水平的事。或者如果涉及个体的极性或对称等的形成，那就是个体水平的了。不论哪个水平的发育，追究到底都可以从有关基因的调节、激活去探索。有关基因在何时被激活，它的产物在何时、如何在不同的水平上起作用，导致出现各个水平的形态发生过程，则是发育生物学的重点所在。研究基因的结构，转录的时刻，转译产物的性质等自然要用分子生物学的方法；研究某种超微结构在发育中的变化，就要应用电子显微镜技术；研究某种蛋白的出现，细胞膜受体等可能需要免疫学技术，如果要离体地研究某种细胞的终末分化，或者不同组织在形成某种构造中的相互作用，就离不开细胞培养或组织培养的技术，显然，在哪个水平上工作，或者研究什么问题，决定了采用什么技术。常用的实验材料一些过去在实验胚胎学中较少使用的，但是对研究某些发育生物学问题有利的材料已受到重视。如果蝇，经过遗传学家几十年的努力，对它的性状遗传已经充分了解，而且培育出大量的突变型。果蝇的有些突变型正是了解某一基因在何时起影响，起什么样的影响的理想材料，这是用野生型做材料无法做到的。虽然果蝇体积较小，难以得到足够的量供生化分析，但有可能通过大量培养和发展微量化检测方法克服这一困难。•小鼠是另一种常用的材料。因为已经培养出一些突变型，而且它的胚胎在体内发育与人类比较接近。另一种使用范围有扩大趋势的材料是一种自由生活的秀丽隐杆线虫，与人类基因的相似程度高达80%。已经用实验方法得到许多突变型。它们繁殖迅速，可以在短期内培养出大量材料供生化分析和提取之用。•2002年诺贝尔生理学或医学奖获得者悉尼·布雷内等三人，他们获奖的原因是在20世纪60年代初期正确选择线虫作为模式生物，发现器官发育和“程序性细胞死亡”过程中的基因规则。布雷内是分子生物学的奠基者之一，他在1965年第一次研究线虫，直到1974年才发表第一篇有关论文，其中经历了长达10年左右默默无闻的基础工作时间。直到20世纪80年代后，线虫研究才逐渐受到国际认可。•线虫成虫体全长只有0.1公分，以细菌为食物，在实验室中极易培养。因为全身透明，研究时不需染色，即可在显微镜下看到线虫体内的器官如肠道、生殖腺等；若使用高倍相位差显微镜，还可达到单一细胞的分辨率。•实验胚胎学的传统材料──棘皮动物、两栖类、鸟类等，仍然是重要的，只是用来研究的问题不同。例如关于早期发育中基因的活动，用海胆作材料的研究曾经提供大量资料。关于器官发生的分析，细胞分化的分子基础，两栖类和鸟类仍然是重要的材料。一、谱系跟踪•定义：将细胞标记后注入胚胎或体外组织，通过对被标记细胞的跟踪可以获得胚胎形成过程中细胞或组织变异的最直接信息，若在某一特定组织发生之前对细胞谱系特异性基因表达进行比较，则可鉴别出细胞谱系的父代组织。一、谱系跟踪•1.细胞谱系（cellline）和系统谱系（genealogicalpedigrees）的跟踪只需将偶联了非扩散高分子葡聚糖的荧光染料注射创立者细胞，使之被标记即可。最近，创立者细胞已采用导入报告基因（通过逆转录病毒、DNA注射或电脉冲转移等）来标记。设计精美的报告基因在有丝分裂时可忠实地复制从而不致在细胞分裂过程中被稀释。细菌的基因lacZ就是很好的报告基因。与一种真核启动区相连接，注射后即能使它在受体细胞中表达。β-半乳糖苷酶基因的转录和转译可通过β-半乳糖苷酶催化产生一种蓝色染料而查出。2.荧光素酶（naturalluciferase）•天然的荧光素酶（naturalluciferase）由萤火虫等许多发光生物的共生菌产生。荧光素酶催化一种一般称作“荧光素”的底物的，由此而发光。当荧光素与ATP加入到可渗透的细胞或细胞提取物中时，由光电倍增管测出的闪光即表示有荧光素酶存在于表达该基因的受体细胞中。3.绿荧光蛋白质（greenfluorescentprotein）•GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。3.绿荧光蛋白质（greenfluorescentprotein）•GFP与水母及其它腔肠动物绿色的生物发光有关。GFP含有一种修饰过的氨基酸（Leu-Tyr-Gly）所组成的载色中心。当GFP基因表达时，GFP中的载色中心即自发形成。由于有该载色中心，甚至在活细胞中心，用普通的荧光显微镜以标准的长波紫外光源就很容易地测出该基因的产物。将外源基因与GFPDNA相连,构成融合基因，再将这种融合基因置于一常用的启动区控制之下，由这种融合基因所编码的多功能的相应蛋白质的表达则通过GFP这部分产生的强荧光反映出来，因此GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.••Babymicefatheredbymicereceivingadonationofspermatogonialstemcellsfrommiceexpressinggreenfluorescentprotein.Onlyhalfthebabymiceshowthegreencolor.Thisisbecauseeachspermatogonialstemcellhasonlyonecopyofthegeneforgreenfluorescentprotein.Whenthespermatogonialcelldivides,onlyhalfthecellsthatresultfromithavethegeneforgreenfluorescentprotein.GFP主要应用:•对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察•可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达,如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。•GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程•GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程•可用于观察分子的运动（FRAP）•蛋白之间的相互作用（FRET）二、诱变与“基因敲除小鼠”•基因敲除：指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平设计实验，将该基因去除，或用其他序列相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测该基因相应功能的方法。二、诱变与“基因敲除小鼠”•要对特定基因的功能和意义作追踪踪迹，有效的手段是设法将该基因完全地剔除（功能丧失的突变），或者通过引入—计划好的突变以精巧的方式影响它的功能。在某些模式生物中引入转座子（如果蝇某些品系的P元件），或者，通过导入侧翼接上取自转座子或逆转录病毒介导插入的序列的外源基因，很容易产生随机突变（插入诱变）。但这种方法无法按所设想改变某一特定的靶基因，受影响的还可能是别的基因。如果导入的DNA序列与所涉基因有相同源的的部分且带有所要的突变，定点诱变可能得以实现。有时，宿主原有的基因会被所导入的基因取代。由于这类事件只在罕见的情况下发生（有些单倍体真菌，尤其是酵母，这种情况却很平常），因此，两个同源染色体中通常只有一个带有该种突变。虽然如此，研究人员还是找到方法来获得两个等位基因均有同样突变的小鼠。•培养的胚胎干（ES）细胞，通过定点诱变使特定的基因失活，可用来产生出标准的“基因敲除小鼠”（Box2）。然后将这种ES细胞注射到小鼠胚胎中，它们则有可能发育成小鼠的各种类型细胞包括生殖细胞。然后将这种动物进行配种，其生殖细胞——卵子与精子——是来源于该ES细胞的动物，则将会把该突变基因传到其后代。经过常规的回交，则可获得纯合型突变。基因敲除小鼠是指运用DNA同源重组原理，迫使所导入的外源基因与小鼠基因组中特定的内源基因（目的基因或靶基因）发生同源重组（这种重组现象又称为定点整合或基因打靶），而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因小鼠。培育基因剔除小鼠的关键技术是ES细胞基因组操作，设法使外源基因能够定点整合到ES细胞基因组中。人们已设计出能够使外源基因定点整合的几种正-负选择（positive-negativeselection，PNS）系统。positive-negativeselection，PNS系统•最常用的PNS系统是由Mansaur等于1988年设计的。这套系统的基本策略是首先构建一个导向载体，其中含有一段与内源的靶基因（以X代表）同源的DNA序列，该同源序列内的一个外显子中插有新霉素抗性基因（neo），以用作正选择的标志，在该同源序列附近还插有疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk），以用作负选择标志。HSV-tk基因本身没有启动子，但可接受neo基因的启动子的调节。•以一定的方法（如显微注射、电穿孔等）将构建的导向载体导入ES细胞，继续体外培养并以药物G418和GANG作双重选择。如果所导入的导向载体DNA与ES细胞基因组DNA之间发生的是非同源重组，则导向载体整个地随机插入ES细胞基因组DNA中，其基因型为X、neo、HSV-tk。此时，neo基因和HSV-tk基因同时表达，其中neo基因的产物使ES细胞具有G418抗性，但HSV-tk基因的产物可使GANG转变为一种有毒的物质，使ES细胞死亡。然而，如果发生的是同源重组，则外源的neo基因便可一并整合到ES细胞的靶基因X座位上，而HSV-tk基因就丢失了。此时，仅有neo基因表达，其产物可使ES细胞具有G418抗性而存活下来。条件性基因敲除法•条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。•利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxPfloxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxPfloxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxPfloxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxPnoxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxPflox