神经生物学研究的常用方法

1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP,从辣根菜中提取的），它的底物是3，3'－二氨基、联苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察。标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidasecomplexmethod,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强。免疫组织化学术近10年来又有新进展，如生物素－亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素－亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素－生物素法（labelledavidin-biotinmethod,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。②桥连亲合素－生物素法（bridgedavidin-biotinmethod,BAB法）：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。③亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素－生物素－过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。7.1.3原位杂交法（insituhybridization）原位杂交术是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。其基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA);②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA);③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。7.2生理学方法神经生物学研究中的生理学方法有行为学方法、神经递质释放量的测定等，其中行为学方法最为常用。7.4.2行为学方法行为学方法是建立在条件反射基础之上。条件反射是著名的俄国生理学家巴甫洛夫于20世纪初提出的。条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化，在非条件反射基础上逐渐形成的。形成条件反射的基本条件就是无关刺激与非条件刺激在时间上的结合，这个过程称为强化。要形成条件反射除需要多次强化外，还需要神经系统的正常活动。巴甫洛夫及其学派所研究的条件反射，称为经典性条件反射。另一种条件反射叫操作性(工具性)条件反射，美国心理学家斯金纳(B．F．skinner)把一只饿鼠放入实验箱内，当它偶然踩在杠杆上时，即喂食以强化这一动作，经多次重复，鼠即会自动踩杠杆而得食。在此基础上还可以进一步训练动物只对某一个待定信号，如灯光、铃声出现后，做出踩杠杆的动作，才给以食物强化，这类必须通过自己某种活动(操作)才能得到强化所形成的条件反射，称为操作性条件反射或工具性条件反射。操作性条件反射和经典性条件反射的基本原理是相同的，它们都以强化和神经系统的正常活动为基本条件，但它们之间也有不同之处。在形成操作性条件反射过程中，动物可以自由地活动，它通过主动操作来达到一定的目的；但在形成经典性条件反射时，动物往往被束缚着，是被动地接受刺激。另外，在操作性条件反射中强化只同反应(操作)有关，并出现在反应之后；而在经典性条件反射中，强化是同刺激有关，而且出现在反应之前。7.4.2电生理学的方法电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。电生理学发源于1791年。电流计的发明和应用于电生理学，初步满足了记录生物电活动的变化量小而变化速度快的特点。1922年Erlanger和Gasser用了电子管放大器和阴极射线示线器，才彻底满足了记录生物电活动的基本特点。从此神经生理学得以迅猛发展。20世纪40年代以来，英国剑桥大学Hodgkin学派利用微电极技术，而且选用了理想的实验标本枪乌贼的巨轴突，在修正了Bernstein膜学说的基础上，建立了动作电位的钠学说，阐明了神经冲动的传导理论。约在同一时期，Forbes和Renshaw等运用微电极开始了研究中枢神经系统神经元活动的工作。Hodgkin等人为精确测量神经活动中的离子运动，发展了电压钳实验技术。电压钳把单一的跨膜离子流从众多的离子流中分离出来，通过离子流的测定来分析离子通道开放及关闭的动力学变化。双微电极电压钳技术是把两根尖端小于0.5μm的玻璃电极插入细胞内分别作为电位记录电极和电流注入电极。电位记录电极引出的膜电位经电压钳仪的前置放大器放大后，输入至电压钳仪的运算放大器的负输入端，而人为控制的指令电位输入其整输入端，两者的不断进行比较，将差值送入驱动放大电路，两者的任何差异都会被放大电路放大，并通过电流注入电极将相反方向的电流注入细胞，是膜电位钳制在指令电位水平。此时，注入细胞的电流值与标本兴奋时的跨膜电流值大小相等，方向相反。在此基础上,Neher又发展了膜片钳技术。它是将尖端直径仅为1μm的玻璃电极吸附到细胞膜表面上，对微电极内施加负压，微电极与细胞膜形成10GΩ的高阻封接，可记录膜上的pA级的离子通道电流，为从分子水平了解生物膜离子单通道的开、关动力学，通透性和选择性提供了直接手段。为此Neher获得1991年诺贝尔医学或生理学奖。在电生理技术中脑电图和诱发电位的描记反映了脑细胞群体活动的总和性电位，在临床诊断方面具有重要价值。神经系统的电生理方法，对神经科学的理论发展起着重要作用。7.3生物化学的方法经典的生物化学方法包括离心、电泳、层析、质谱等。由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又发展了放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)、放射受体和免疫印迹等方面。离心法是各种制备、鉴定方法的起始步骤，几乎没有一个实验没有离心法，也几乎没有一个实验仅用离心法就能完成。各种层析法是用来制备、鉴定和分离物质的主要手段，通常需将几种不同的层析法交替使用，才能达到预期的结果。由于HPLC和FPLC的使用，使分离的效率和分辨率大大提高。RIA是用来检测生物体内低含量物质（如神经介质、激素）的重要手段，也是对抗体进行检验的重要手段。RIA主要用来分析研究受体的特性，也可用于测定某一受体的配体的含量及分析比较各种配体的作用强度。免疫印迹法结合了电泳及KIA的优点，是鉴定蛋白质及肽类分子的理想方法。7.4分子生物学的方法分子生物学技术同神经生物学结合产生了分子神经生物学，分子生物学技术在神经生物学中的应用有基因的分子克隆及表达、聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）、遗传连锁分析、反向遗传学等。7.4.2PCRPCR是利用耐高温的DNA聚合酶体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。PCR技术原理