李金明-个体化医学检测质量保证指南(简)

个体化医学检测质量保证指南李金明国家卫生计生委临床检验中心适用范围本指南适用于通过分析基因及基因结构改变、基因表达及代谢变化，对患者疾病进行预测、诊断、治疗决策、监测和预后的临床检测。质量保证标本采集、运送和保存（分析前）室内质控（分析中）室间质评（分析中）结果报告解释及临床应用（分析后）涉及临床医生标本采集环节和实验室涉及实验室人员和临床医生涉及实验室涉及实验室分析前质量保证申请单应包括的内容1.患者的惟一标识：患者的姓名、出生日期、性别、民族、住院号、就诊科室、床号，有条件的医院尽量使用条码标志或其他唯一标示；2.样本的类型：血液、其他体液、活检组织、手术切除样本等；3.所申请的检验项目；4.患者的相关临床资料，包括初步诊断结果；5.样本采集日期和采集时间；6.实验室接受样本的日期和时间；7.与检验有关的既往史等；8.样本是否合格：有无癌变组织、血液样本有无溶血、容器有无破损等。9.医生的签名。患者的正确识别在对患者进行取血或采样前，检验人员需要首先确定患者的身份。在对患者进行确认时，应准确核实患者的姓名、性别、住院号等信息。对于不能说话的或意识不清醒的患者应由相关陪同人员、医生或护士加以确认。如果有腕带，患者的腕带上通常附有上述信息，采血或取其他临床样本时检验人员应先确认这些信息。样本的采集、运送和保存（1）1.基本原则（1）应按照CFDA批准的检测试剂说明书制订的标准操作程序（SOP）进行。如为实验室自制试剂，则实验室应当建立样本的采集、运送和保存的SOP，并严格执行。（2）样本采集和运送容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物。血液和骨髓穿刺样本通常需要先抗凝，抗凝剂一般应EDTA和枸橼酸盐，避免使用肝素。如检测的靶核酸为胞内RNA，试管内应含有一定量的RNA稳定剂。（3）实验室应向样本采集人员明确以下信息（如有可能体现在申请单中），具体包括：采集时间；采集部位；样本类型；采集量；采样质量的要求；拒收样本的类型。（4）样本运送和保存中的生物安全。样本的采集、运送和保存（2）（5）样本运送温度和时间的要求。DNA检测样本，可室温下运送，建议8h内送至实验室。靶核酸为RNA时，10min可室温运送，如所需运送时间较长，则应将样本置于冰上，必须保证样本与冰屑充分接触，且冰屑应达到样本的高度，建议采集后4h内送到。冰冻组织样本最好保证其在运送过程中不发生融化，石蜡包埋组织则可在室温下运送。（6）样本保存温度和时间的要求。用于DNA检测时，样本可在2~8℃保存72h。用于RNA检测时，样本一旦采集送达实验室后，如不能立即提取，应冻存于-70℃。临床体液样本的长期保存（2周）在保存于-70℃。已提取纯化的RNA最好在乙醇沉淀后保存在-70℃。如果样本中含有红细胞，应尽可能去除红细胞后，再进行冻存。石蜡包埋组织则可在2-8℃长期保存。常见标本的类型血液分泌物胸腹水痰粪便尿脑脊液胚胎样本骨髓穿刺样本/细针穿刺细胞组织（新鲜组织、活检组织、手术切除样本、甲醛固定的石蜡包埋组织（FFPET））临床分子诊断样本的接收样本拒收标准：容器破损、量不够、时间不符合要求、重度溶血、重度脂血、重度黄胆、无靶细胞？用于肿瘤组织基因突变检测的样本，在分子检测须由病理医师进行镜下肿瘤细胞评估，然后富集肿瘤肿瘤细胞用于核酸提取。肿瘤细胞所占比例应达到所用扩增检测方法的要求纯化后的DNA和RNA的保存DNA：如果纯化后的DNA无DNA酶的污染，则可在TE缓冲液中室温保存26周；2-8℃保存一年；-20℃保存7年；-70℃保存7年以上。怀疑可能存在DNA酶污染的样本，则保存在-20℃以下。RNA：RNA易于降解，在-20℃条件下，RNA酶也可能发挥作用。因此，纯化后的RNA应当经过乙醇沉淀，并在-70℃以下保存。分析中的质量保证临床基因扩增检验实验室设计产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间实验室仪器设备及管理加样器：维护、校准扩增仪：维护、校准恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准离心机：维护生物安全柜：维护冰箱：维护基因扩增仪器设备的质控仪器设备质控方法频度失控标准扩增仪仪器校验实验当仪器移动时实验失败热电偶监测温度扩增功能检测每月一次每4个月一次如靶温度或温度差异超出允许范围待测孔未出现扩增，检测温度程序打印每次测定时打印程序不对加样器校准每年2次不符合要求水浴箱温度检测每次实验不符合要求酶标仪预防性维护及校准每年2次不符合要求理想的试剂试剂方法的性能验证及每批试剂的质检性能指标：精密度（重复性）准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等）线性范围（定量）分析特异性测定下限抗干扰能力“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）如果不按商品试剂盒说明书操作或改变商品试剂盒组份是否可以？可以但属于实验室自配试剂或自建方法，亦即Laboratory-developedtests,LDTs)“性能确认”（“validation”）定义TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”as“confirmationbyexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”.（通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期用途的要求始终能得到满足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowithintendeduse.（性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）“intendeduse”预期用途Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythemanufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthetest.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealthOrganization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedandachievestheintendedresult”.（WHO将validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程））“validation”通俗一点的定义theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在测定方法研发时，最早建立的分析性能特征）性能验证与性能确认的实际操作区别性能指标及所建议的研究要求FDA批准的检测实验室自建方法或自配试剂（LDT）可报告范围,线性范围研究(定量检测)覆盖所述线性范围内5~7个浓度，每个浓度双份检测覆盖预计测定范围内（或超出所确定的最宽的可能范围的20〜30%）7~9个浓度，每个浓度2~3个重复检测，进行多项回归分析分析敏感性，测定下限（LOD）研究CLIA不要求，但CAP要求对定量进行LOD验证，使用在5天内收集的20个数据点60个数据点（例如在预计的检测下限范围内5个样本，12次重复），研究时间5天，使用probit回归分析（或如果采用LOB研究，则使用SD加置信限）精密度,重复实验定性检测：检测1个对照/天，共20天，或双份重复/天，共10天。定量检测：2个浓度的每1个检测2个样本（共4个样本），加1个对照，检测20天，或检测2个浓度，3管重复，检测5天定性检测：最少3个浓度（LOD、LOD+20%、LOD-20％），获得40个数据点。定量检测：最少3个浓度（高、低和LOD），双管重复检测1~2次/天，检测20天，计算批内、批间、每天之间SD和/或CV，以及总的变异分析特异性,干扰研究CLIA不要求未建议最小样本数量；检测样本相关的干扰物质（溶血、脂血、黄疸等）和遗传上相似的微生物或具有相同临床表现同一样本位点可见到的微生物，加入低浓度待测物质。采用t检测统计分析。准确度（正确度），方法学比较研究在检测范围内的20个患者样本或2个浓度（低和高）标准物质，复管检测2~5批。